抗菌肽基因表达系统的研究进展

乐山职业技术学院 唐 勇

抗菌肽（AP）是生物细胞特定基因编码产生的一类具有抑菌或杀菌功能的小分子多肽，其广泛存在于自然界生物体内，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。抗菌肽具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点。另外，抗菌肽还具有抗肿瘤活性，且对正常哺乳细胞毒性小。目前，可通过基因工程的方法大量获得抗菌肽，这使得抗菌肽的深入研究和广泛应用成为可能。

1 抗菌肽的合成方式

抗菌肽可以通过以下三种方法获得：（1）用生物化学方法直接分离抗菌肽。通过人工诱导内源性抗菌肽的表达，一般是注射抗原后通过获得组织匀浆，再进行分离纯化和活性研究 （Hara和Yamakawa，1995）。但分离提纯过程繁琐，且不同的试验条件对于组分的纯度影响很大。天然存在的抗菌肽产量很低，无法从动植物体内大量提取。（2）化学方法可合成抗菌肽，但价格较昂贵。（3）利用基因工程技术生产抗菌肽。目前，基因重组表达的方法是获得大量抗菌肽最经济的方法。但是，由于抗菌肽是小分子的碱性多肽，极易受到蛋白酶的攻击，而且表达产物往往对宿主细胞有毒性，因此，抗菌肽的外源表达较其他的多肽类药物更为困难。大量相关研究对不同来源的抗菌肽进行了重组表达的尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统，毕赤酵母系统、昆虫系统等。

2 抗菌肽基因表达系统

2.1 大肠杆菌表达系统 在过去的20年里，对大肠杆菌系统的遗传学、生物化学和分子生物学方面有了充分的认识，使之成为表达许多外源蛋白的首选表达系统（Townes等，2004）。大肠杆菌遗传图谱明确，易培养，周期短，费用低，对许多蛋白质有较强的耐受能力，能较高水平地表达多种蛋白质。因此，大肠杆菌是应用于DNA重组技术的主要宿主细菌。

防止抗菌肽对表达宿主菌的伤害，是提高抗菌肽基因表达水平的关键问题。现在一般采用融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达抗菌肽基因。融合蛋白表达法是在抗菌肽的N端连接一段适合在细菌中表达的蛋白质序列，宿主菌表达出这样的融合蛋白没有杀菌活性，不会对宿主造成伤害，从而提高了抗菌肽基因的表达水平（Mwthy，2004；Sebastian 等，2003；Zhang 等，1998）。 同时，抗菌肽是一段短肽，容易被胞内酶降解，融合蛋白表达也可以防止短肽的降解。目前成功的融合表达系统主要有：（1）谷胱甘肽转移酶（GST）系统，融合蛋白通过谷胱甘肽-agarose进行亲和纯化后，用凝血酶或Xa因子切除融合蛋白的GST部分，获得目的蛋白。（2）β-半乳糖苷酶系统，融合蛋白用氨基苯硫代半乳糖苷酶（TPEG）-Sepharose进行亲和纯化。（3）麦芽糖结合蛋白（MBP）系统，通过直链淀粉交联纤维素亲和层析分离纯化（Aitken 等，1994）。

Peng 等（2004）将人 β-防御素 2（hBD2）的基因插入到pET-32a（+）中构建融合表达载体，以大肠杆菌BL21为工程菌，在10 L发酵罐中进行IPTG诱导表达，通过调整各种参数实现了hBD2的可溶性表达，产量达到 1.31 g/L，占菌体可溶性蛋白总量的41.6%，纯化后的蛋白具有抗菌活性，研究显示了应用基因工程技术大规模制备抗菌肽的可能。Li等（2006）采用大肠杆菌融合表达系统成功表达了抗菌肽LL-37，表达产物以融合蛋白形式得到，需要去除融合伴侣后才能表现应有的抗菌活性。杨旭（2006）利用GST融合表达系统在大肠杆菌中正常表达了抗菌肽基因Pexiganan和IB-367，表达产物经Xa因子酶切后显示出抗菌活性。李伟和陈松林（2007）将牙鲆抗菌肽hepcidin基因重组至融合表达载体pGEX-4T-1中，转化至大肠杆菌BL21（DE3）plyS中，表达的融合蛋白最高占总蛋白含量的21%。纯化得到的融合蛋白用凝血酶切割后，经亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin。抑菌试验结果表明，该抗菌肽对大肠杆菌（ATCC25922）有一定程度的抑制作用。Lu等（2008）以pET28α为载体，将经改造后的人胰岛素原（mhpI）与 GK1 的融合基因（mhpI-GK1）转入至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。抑菌试验表明，纯化后的重组GK1和化学合成GK1具有相同的抗菌活性，为基因工程方法大规模生产GK1奠定了基础。赵华等（2012）构建的抗菌肽parasin I大肠杆菌重组表达载体，转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株进行诱导表达，表达产物经Xa因子酶切后具抑菌活性。

综合以上研究表明，大肠杆菌表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统，能够在较短时间内获得基因表达产物，所需成本相对较低。但大肠杆菌表达系统也常常无法得到有活性的抗菌肽，一方面，可能因为在原核表达系统中抗菌肽的二硫键无法正确形成，影响了蛋白的正确折叠导致无活性；另一方面，在原核表达系统中抗菌肽无法得到酰胺化修饰，也会影响其活性。另外，目的蛋白常以包涵体形式表达，包涵体虽然利于分离纯化，但是对表达产物的活性不利。

2.2 毕赤酵母表达系统 酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。其中毕赤酵母近年来应用最为广泛的。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能利用甲醇作为唯一碳源。它具有一个很强的可被诱导的甲醇利用途径，乙醇氧化酶（AOX）是甲醇利用途径的第一个酶，甲醇是该酶的诱导剂，而葡萄糖、乙醇、甘油等则是抑制剂。

根据信号肽能被正确加工、切除，使表达产物具有生物活性。现在一般多用两步法来诱导抗菌肽的表达，即表达菌株首先在以甘油为碳源的培养基中生长，细胞大量增加而抗菌肽表达受到抑制；当甘油耗尽时，加入甲醇来诱导抗菌肽表达（Cereghino和Cregg，2000）。毕赤酵母表达系统不仅表达产物均分泌于培养液中，而且毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于抗菌肽的纯化。赖玉平等 （2004）将在人体汗腺中发现的抗菌肽DCD-1L基因克隆到毕赤酵母载体pPIC9k中，并在毕赤酵母GS115中进行了表达。结果表明，GS115系统所表达的DCD-1L在pH5.5～7.4具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。申艳敏等 （2008）在毕赤酵母中高效表达了人源抗菌肽LL-37，检测显示LL-37对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性。尹娜等（2008）采用毕赤酵母系统，成功地分泌表达了具有生物活性的抗菌肽Cecropin D，并检测到Cecropin D对大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用。Jin等（2009）将抗菌肽Cecropin AD克隆到毕赤酵母载体pPICZa-A中，将SalI线形化的重组质粒pPICZa-C AD通过电穿孔转化毕赤酵母GS115，经1.0%甲醇诱导96 h后成功表达了抗菌肽Cecropin AD，并检测到其对真菌、革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌均有抑菌作用。高宇等（2012）通过RT-PCR等分子生物学技术，从中华鲟血液中克隆获得抗菌肽Hepcidin基因，并建立该基因去信号肽后序列的高效表达融合载体，通过转化到毕赤酵母中进行诱导表达，并通过牛津杯法证实其体外抗菌活性。

通过上述研究发现，在以毕赤酵母为宿主菌的抗菌肽基因工程研究中，多数均实现了目的蛋白的分泌表达，并且产物没有对工程菌产生明显的抑制作用，这表明某些抗菌肽对酵母的毒性较小，因而更适于在该系统中表达。当然，具体到某一种抗菌肽是否适合在酵母中表达，以什么样的策略来构建载体，还需根据其活性特点具体分析。

2.3 昆虫表达系统 昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，其具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫是抗菌肽的重要来源，第一个抗菌肽cecropin就是在家蚕蛹中被发现的。因为抗菌肽主要来源于真核生物，在形成成熟肽之前，需经过一些翻译后的修饰，昆虫系统具有对蛋白质进行酰胺化和糖基化等修饰的能力，因此在试图将抗菌肽进行外源表达的时候，人们很容易想到利用昆虫系统。目前，多以核型多角病毒为载体在家蚕培养细胞或虫体内表达抗菌肽。Smith等（1983）采用基因工程技术首先建立了苜蓿银纹夜蛾核型多角病毒（Ac-NPV）载体系统，即以AcNPV为载体，用培养的昆虫细胞为宿主进行外源基因表达。Hellers等（1991）将编码天蚕素肽原的前体片段克隆到苜蓿斜纹蛾核型多角体病毒启动子的下游，目的基因成功地在重组感染的粉纹夜蛾末龄幼虫和天蚕滞育蛹中表达，且产量高达600 μg/mL血淋巴水平。Kim 等（1998）在家蚕（Bombyx mori）cDNA 库中克隆了一个新抗菌肽的基因，编码59个氨基酸的Enbocin，并在昆虫细胞Sf21中得到了表达，表达产物对G+和G-细菌均表现出较强的抑菌活性。

3 小结

总之，各种抗菌肽基因表达系统均各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低，但翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。毕赤酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力，但发酵周期较长，易污染，且长时间的发酵不利于外源蛋白的表达；利用易燃的甲醇作原料，表达产物的卫生安全性需要考虑。昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系操作繁琐。因此，选择表达系统时，应充分考虑各种因素，如生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入，通过基因克隆与表达而大量生产抗菌肽成为可能。但如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，真正实现生产规模化、产业化，还需要进行更多的探索和尝试。

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