48例传染性单核细胞增多症患儿EB病毒核酸定量和异型淋巴细胞的实验室临床意义

陈德林 潘丽

48例传染性单核细胞增多症患儿EB病毒核酸定量和异型淋巴细胞的实验室临床意义

陈德林 潘丽

目的研究传染性单核细胞增多症(以下简称传单)患儿实验室检测中EB病毒DNA和异型淋巴细胞的辅助诊断的临床意义。方法采取实时荧光PCR技术来定量检测EB病毒DNA的含量拷贝数(＞1.0×103为阳性)和血液室异型淋巴细胞计数检测比例(＞4%为阳性)。结果在48例传单患者中，EB病毒DNA＞1.0×103(阳性)40例，EB病毒DNA＜1.0×103(阴性)8例。异型淋巴细胞＞4%(阳性)22例，异型淋巴细胞＜4%(阴性)26例。EB病毒DNA阳性率占83.3%;异型淋巴细胞阳性率占45.8%。说明实验室检测对传单患儿有较高的辅助诊断价值。结论EB病毒DNA定量拷贝数检测有相当高的诊断价值，为临床提供传单患者的快速诊断;异型淋巴细胞检测具有45.8%阳性辅助诊断价值，虽然辅助诊断价值没有核酸检测高，但是对实验室条件要求不高，更适合不具备条件开展分子生物实验室的基层医院开展辅助诊断传单患者。

传单患者;EB病毒DNA;异型淋巴细胞;相关性

疱疹病毒是一较大的囊膜的双链DNA病毒，分为A群和B群两个亚群。凡在体外培养时，容易从细胞内释放营养液中的病毒为A群;病毒同细胞紧密结合，很难释放到营养液中的为B群。基因组结构由末端重复序列和内部重复序列组成，疱疹病毒基因可以整合于细胞的基因内，成为细胞DNA的一部分，形成长期潜伏感染状态，疱疹病毒潜伏感染与肿瘤发生有关，尤其与鼻咽癌密切相关，EB病毒属疱疹病毒4型，EB病毒感染可引起传染性单核细胞增多症、鼻咽癌、儿童淋巴瘤。传染性单核细胞增多症是我国常见的幼儿传染病，人群普遍易感，是由EB病毒引起的急性传染病，EB病毒是一种嗜淋巴细胞病毒，70%淋巴细胞细胞增多，而且异型淋巴细胞明显增多［1］，传单患者大部分鼻咽部含有EB病毒。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有标本均来自本院确诊的病房患者和部分门诊患者，由护理人员抽取患者静脉血2～3 ml注入EDTA-K2抗凝管中送检，用水平离心机1500r/min离心10 min编号待测。男性30人，女性18人;年龄最小6月，最大13岁，平均年龄4.1岁，且均为临床上最后确诊为传染性单核细胞增多症48例，其中EB病毒DNA定量拷贝数＞1.0×103(阳性)40例，异淋巴细胞＞4%(阳性)22例。

1.2 异淋巴细胞检测仪器、试剂及方法 异型淋巴细胞检测EDTA-K2抗凝全血用SYSMEX-2100血流流水线上自动推片机进行推片，自动瑞士染液染色的血片，由经验丰富的血液工作人员两人共阅片求出的均值作为最后异型淋巴细胞计数值(＞4%为阳性)。

1.3 EB病毒DNA定量检测仪器、试剂及方法 使用罗氏(LightCycler®480)480PCR扩增分析仪，采用中山大学达安基因试剂盒进行定量聚合酶链反应(PCR)检测，方法为实时荧光PCR技术进行定量检测。质量控制:查看阴性，阳性及标准定值是否吻合决定此次检测情况。阴性质控品:增长曲线不呈“3”型曲线或Ct=30，阳性质控品:增长曲线呈“3”型线，且强阳性质控品定量参值在1.0×106～2.0×108范围，临界阳性质控品参考值在2.0×102～2.0×104IU/ml范围(参考值为仪器自动分析计算出的数值)。阳性定量参考品:全部阳性，且线性相关系数0.97≤∣r∣≤1。测定结果有效必须具备以上质控条件同时满足，否则结果无效，需重做实验。检测EB病毒DNA灵敏检测范围在102～107拷贝/ml之间。

1.4 操作步骤

1.4.1 异型淋巴细胞检测EDTA-K2抗凝全血充分混匀20次后，用SYSMEX-2100血液流水线上自动推片机进行推片，自动瑞氏染液染色的血片，由经验丰富的血液工作人员两人共阅血片的体尾部细胞分布均匀的部位，求出的均值作为最后异型淋巴细胞计数值(＞4%为阳性)。

1.4.2 EB病毒DNA的定量测定

1.4.2.1 DNA提取(标本处理区) ①取1.5 ml灭菌离心管编号(与标本同号)。②取50 μl DNA提取液于1.5 ml灭菌离心管中，细心提取血清与血细胞交界处的白细胞层，尽量吸完放入灭菌离心管中，充分吹打混匀约静置5 min。③振荡器剧烈振荡混匀5～10 s，置(100±1)℃恒温金属浴中孵育(10±1)min，12000r/min离心5 min备用。

1.4.2.2 试剂准备(试剂准备区) ①从冰箱中取出EB病毒DNA检测试剂，室温解冻，取0.2 ml样品扩增八连管，按比例加入EB病毒DNA-PCR反应液40 μl+Taq酶3 μl/人份至八连管中。②将加好试剂的扩增八连管放入试剂准备区和标本处理区之间的传递窗中。③加样:在标本处理区从传递窗中取出加好试剂的八连管于生物安全柜中加样，分别依次加入处理好的标本上清液2 μl，阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品后，盖上密封条密闭，8000 r/min离心数秒。④将处理好的样本放入标本处理区和扩增区之间的传递窗中，准备扩增。

1.4.2.3 样品扩增(PCR扩增区) ①打开扩增区电脑及LightCycler®480主机，查看反应条件是否吻合，否则重新设置。②从传递窗中取出准备好的样品扩增管，放入LightCycler®480主机仪器扩增板内，再放进LightCycler®480主机进行扩增。

2 结果

2.1 异型淋巴细胞＞4%(阳性组)的22例，EB病毒DNA检测值＞1.0×103(阳性组)标本40例，见表1。

2.2 结果发现在临床确诊的传染性单核细胞增多症48例患者中，EB病毒DNA定量核酸检测阳性达83.3%，由于核酸检测速度快，使用EDTA-K2抗凝全血采样方便，对传染性单核细胞增多症患者有非常高的早期诊断价值，EDTA-K2抗凝全血涂片查异型淋巴细胞对传染性单核细胞增多症诊断阳性率也高达45.8%(高于文献2所述［2］)，此次研究发现EB病毒DNA定量核酸检测明显高于血涂片查异型淋巴细胞对传染性单核细胞增多症，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 统计方法处理 t检验。

表1 EB病毒核酸定量和异型淋巴细胞相关性比较［例数(%)］

3 讨论

】EB病毒感染引起的传染病，人员普遍易感，EB病毒(EBV)几乎与所有鼻咽癌有关;EB病毒(EBV)对诊断传染性单核细胞增多症至关重要;EB病毒(EBV)还同Burkitt淋巴瘤、免疫损伤性患者的淋巴瘤有关;EB病毒(EBV)同时也可能与何杰金氏病(Hodgkinsdisease)、慢性疲劳综合征、移植后淋巴组织增生症等有关;检测 EBV病毒的PCR(EBVDNA)，PCR荧光定量技术可从少量标本中扩增检测出所需DNA，适用于多种不同标本的检测。为临床检测、普查EBV提供快速、准确的检测手段。

本次检测的均为临床确诊的传染性单核细胞增多症患者，传染性单核细胞增多症是由EB病毒感染引起的传染病，人员普遍易感。EB病毒(EBV)核酸检测对诊断传染性单核细胞增多症至关重要，本次是EDTA-K2抗凝全血提白细胞层检测核酸检测，阳性率高达83.3%高于文献3中所述［3］，而且具有采样方便，检测时间快;可能阳性率更高，非常高的早期诊断价值诊断价值。此次实验检测没有取鼻咽部分泌物进行核酸检测，传染性单核细胞增多症患者大部分鼻咽部含有EB病毒，采样更方便，可能阳性率更高。

EB病毒是一种嗜淋巴细胞病毒，70%传染性单核细胞增多症患者淋巴细胞细胞增多，而且异型淋巴细胞也明显增多，可见异型淋巴细胞也是实验室辅助诊断传染性单核细胞增多症的重要方法，阳性率45.8%高于文献4中所述［4］。虽然不如核酸检测阳性率的临床意义大。但是对实验环境要求不高，适合于各级实验室，更适合于不具备条件开展PCR核酸检测的医院辅助诊断传染性单核细胞增多症。

［1］ 陈尚明，黄海英.小儿传染性单核细胞增多症72例临床分析.南通医学院学报，2009，29(4):305 －307.

［2］ 陆丹，胡兴文，曾菊.儿童EB病毒感染与异型淋巴细胞相关性分析，中国实验诊断学，2009，13(12):1732 －1734.

［3］ 于谨铭，罗兵，李咏梅，等.EBV-DNA检测在儿童EB病毒感染中的临床意义.医学检验与临床，2012，23(5):8－10.

［4］ 刘莹，曹军皓，容东宁，等.传染性单核细胞增多症.异型淋巴细胞数量与EB病毒浓度的关系.实验医学杂志，2008，24(20):3582－3583.

563000 遵义市第一人民医院检验科