泛素-蛋白酶体系统的不对称分离与T细胞命运决定

周立强 沈关心 (华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉430030)

在干细胞的不对称分裂中，母细胞分裂成为具有不同命运的两个子细胞[1]。在这个过程中，关键的命运决定因子定位在分裂细胞的一极，并引起两个子细胞获得不同数量的关键决定因子。在果蝇(Drosophila)的神经元干细胞中，转录因子Prospero作为终末分化和自我更新的开关[1]。

而在效应T细胞和记忆T细胞的命运决定中，也发现一些关键的转录调节因子[2-5]。遗传证据提示，T 盒转录因子(T-box transcription factor，T-bet)，在激活的初始CD8+T细胞中是一个关键的命运决定因子，能促使初始CD8+T细胞分化成为效应T细胞，而抑制初始CD8+T细胞向记忆T细胞转变[2]。在激活的初始CD4+T细胞中，T-bet促进初始CD4+T细胞向Th1细胞转变，而抑制初始CD4+T细胞向Th2和Th12细胞群转变[6]。这些因子在数量上的小变化将显著影响T细胞的命运[2-5]。上述结果提示，这些关键因子的不对称分离，能决定T细胞命运。

1 泛素-蛋白酶体系统降解途径的简介

泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomal system，UPS)由包括泛素(Ubiquitin)、泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzymes，E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes，E2)、泛素连接酶(Ubiquitin ligases，E3)、蛋白酶体(Proteasomes)和去泛素化酶(Deubiquitinases，Dub)在内的至少6个组分组成。泛素是这个系统的中心，在E1、E2和E3的作用下能与需降解的靶蛋白相结合，并且能被Dub 从靶蛋白上解除[7]。

泛素仅仅在真核生物中被发现，在大部分组织中表达，且高度保守。泛素通过泛素化的方式来调节其靶蛋白，从而参与细胞的活动过程[7]。理论上，蛋白中任何赖氨酸残基均能被泛素链接，包括泛素自身。而泛素化靶蛋白生物功能的不同，取决于泛素化类型。

泛素化可分为三种类型[8]:①单泛素化(Monoubiquitination);②多次泛素化(Multiubiquitination or polymonoubiquitination):蛋白被多次单泛素化;③多泛素化(Polyubiquitination):蛋白被多泛素链所结合。不同的泛素化类型调节不同的细胞过程，包括蛋白降解、信号转导、跨膜运输、DNA修复、染色体重塑(Chromatin remodeling)、过氧化物酶体的生物合成(Peroxisome biogenesis)和病毒发芽(Viral budding)。例如在泛素的第11位赖氨酸(11th lysine，K11)和第48位赖氨酸(48th lysine，K48)的多泛素化主要参与蛋白降解[8]。

泛素化过程，也称为泛素化级联反应(Ubiquitination cascade)，是一个ATP依赖的酶催化反应，需要至少三种类型的酶，包括 E1、E2和 E3[9]。泛素通过E1使用ATP作为能量的来源形成泛素-腺苷中间体(Ubiquitin-adenylate intermediate)而被激活。接着，泛素被转移到E1活化位点(半胱氨酸残基)，而引起形成泛素的羰基C-末端和E1的半胱氨酸巯基之间的硫酯键。随后，激活的泛素通过反式(硫代)酯化反应[trans(thio)esterification reaction]从E1转移到E2的半胱氨酸活化位点上。最后，能识别靶蛋白的特异识别分子的E3，通过与E2和底物相互作用，使得靶蛋白的赖氨酸和泛素的甘氨酸C-末端之间形成异肽键(Isopeptide bond)[10]。

在人类的基因组中，有两个基因编码E1，60～100 个基因编码 E2s，1000 多个基因编码 E3s[7]。这些酶形成一个等级结构，控制整个泛素化过程。在泛素化级联反应中，E1能结合几十个E2s，E2s又能结合上百个E3s，E3s特异性结合上千个靶蛋白[10]。

蛋白酶体是一个分子量超过2000道尔顿，由一个20S的核心颗粒和两个19S的调节颗粒组成的26S的桶状大蛋白复合体。蛋白的K48或者K11被多泛素化后，将在桶状蛋白内水解[8]。

Fuentealba等[11]最近研究发现，在细胞分裂时，泛素化的待降解蛋白被一个子细胞所遗传。在分裂的人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫组化染色可见，在80% ～90%的有丝分裂中，不同位点的多泛素化的同一种蛋白是不对称分离的，提示这种不对称分离可能导致子细胞的不同命运。Narimatsu等[12]发现，E3参与了细胞的不对称分裂过程。Chang等[13]研究发现，蛋白酶体的不对称分离参与了一种T细胞命运决定因子的不对称分离的过程，从而导致T细胞的不同命运。这些结果提示，UPS可能通过引起T细胞内关键蛋白的不对称分离，从而引起 T细胞不对称分裂的命运。

2 蛋白酶体不对称分离与T细胞命运决定

2.1 蛋白酶体不对称分离的发现 2011年，Chang等[13]的研究发现，在激活的初始T细胞进行分裂过程中，T-bet在子细胞之间发生不对称分离。并且，T-bet的不对称性调节机制与有丝分裂过程中蛋白酶体依赖的降解机制的不对称分布有关。蛋白酶体的定位与T-bet相反，以至于获得少量蛋白酶体的子细胞获得更多的T-bet。T-bet的不对称性能通过抑制蛋白酶体依赖的降解而被阻止，表明T-bet和蛋白酶体的不对称分布相关。在有丝分裂过程中，抑制蛋白酶体的不对称分离，可阻止T-bet的不对称分离。根据这些发现，蛋白酶体的不对称分离，引起有丝分裂过程中决定因子的不对称降解，使得关键决定因子不对称分类进入两子细胞。

蛋白酶体的不对称分离引起T-bet在母细胞分裂过程中的不对称分离，导致T-bet在子细胞中的数量上的异常，从而将导致子细胞的不同命运。遗传获得T-bet多的初始CD8+T细胞分化为效应T细胞，而获得T-bet少的细胞则向记忆T细胞转变;遗传获得T-bet多的初始CD4+T细胞分化为Th1细胞，而获得T-bet少的细胞则向Th2和Th12细胞转变。

2.2 参与蛋白酶体不对称分离的机制 Chang等[13]的研究提示，酪氨酸激酶ITK可能是一个关键信号。ITK参与T细胞受体结合的下游事件，并对T细胞的发展和分化途径起作用[14]。目前的研究提示ITK的另一作用是在有丝分裂的过程中，使得T-bet被蛋白酶体依赖的降解途经所降解。在ITK缺陷的T细胞，将使得T-bet的不对称分离的现象不存在，并且不能使T-bet进入远端的子细胞(The distal daughter cell)，干扰子细胞的能力而变成记忆细胞。这些结果提示ITK在CD8+记忆细胞发育中的起作用[15]。在CD4+T细胞也是相似的。ITK缺陷导致T-bet不对称性消失，向Th2细胞转化减少。这与在ITK缺陷的小鼠中观察到Th2细胞分化障碍的结果一致[16]。

3 泛素化蛋白的不对称分离与子细胞

3.1 泛素化蛋白的不对称分离的发现 自从1882年Flemming描述了有丝分裂后，对于体细胞分裂的研究集中在细胞物质的均等分离上，特别是染色体和参与有丝分裂的细胞器[17]。而现在发现，许多有丝分裂是不均等的，比如待蛋白酶体降解的泛素化蛋白。研究发现，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)诱发的Smad1信号能被复杂的UPS降解途径所调节[11]。Smad1在被BMP受体(BMP receptor，BMPR)进行C-末端磷酸化而激活后，被MAPK(Mitogen-activated protein kinases)和糖原合酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3，GSK3)在其连接区域连续磷酸化。MAPK和GSK3的磷酸化对于Smad1的多泛素化和降解是必要的[18]。Fuentealba等[11]使用针对第214位丝氨酸(Ser-214，pS-mad1MAPK)和第210位丝氨酸(Ser-210，pSmad1GSK3)的磷酸化特异性抗体(potent phospho-specific antibodies)追踪细胞内Smad1蛋白的定位，发现Smad1蛋白被特异性降解。在分裂的人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫组化染色显示，在80%～90%的有丝分裂中，pSmad1MAPK和pS-mad1GSK3是不对称分裂的，而总的Smad1是均匀的。这种现象是意想不到的，因为hESCs的自我更新的分裂一直被认为是对称分裂[19]。同样使用Cos7细胞，pSmad1MAPK、pSmad1GSK3、被 GSK3 磷酸化的 β-连环蛋白、所有多泛素化的蛋白也是不对称分裂的。这种不对称分布至少连续保持三代。泛素化蛋白的不对称性也发生在体内，因为在胚盘阶段的果蝇(Drosophila)胚胎中，MAPK磷酸化的Mad临近两个中心体的一个，提示体内的不对称现象。

3.2 泛素化蛋白不对称分离的机制 众所周知，中心体能确保细胞进行均等的有丝分裂，并由两个被基质蛋白(matrix of proteins)[例如γ-微管蛋白和中心粒周围蛋白(Pericentrin)]所形成的微管组织中心[microtubule-organizing center(MTOC)]所包围的小中心粒组成[17]。最近研究发现，中心体还在细胞中担当蛋白水解中心的角色，用蛋白酶体抑制剂处理哺乳动物细胞群中，未降解蛋白积累，并引起中心体周围物质(Peripheral centrosomal material)显著增多[20]。蛋白酶体集中在许多细胞群的中心体[21]。最近的研究发现，需降解的泛素化Smad1定位在Cos7细胞的中心体区域[18]。

中心粒是半保留式复制[17]，在大部分分裂间期，中心体或微管辐射的细胞中心仍优先与母中心粒相关[22]。在干细胞分化过程中，不对称细胞分裂已经被证实[23]。在一些情况下，母中心体在不对称分裂过程中与干细胞相关[11]。因此，中心体周围物质的不对称遗传影响干细胞分化的结果。

Fuentealba等人[11]推测在中心粒分裂时的中心体周围蛋白不对称遗传并在G2/M转换时迁移到细胞的另一极。在G2/M期，中心粒分离而中心体周围物质仍保留在一极。而这种不对称分布是为了让中心体周围物质被一个子细胞所遗传。

3.3 泛素化蛋白不对称分离的意义 从功能的观点来看，待降解的泛素化蛋白的不对称分裂使得只有一个子代细胞被遗传这些蛋白，而这对于那些难降解蛋白是非常有意义的，并与帕金森病、阿尔海默病和亨廷顿病相关[24]。有可能，积累太多的难降解蛋白的增殖细胞会凋亡。因此，分裂的细胞群进行这种生理机制在细胞分裂时清除自身需降解的蛋白。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，损伤的羰基化蛋白质选择性的保留在母细胞中而没有被出芽所遗传，而这可能是维持新生细胞健康的机制[25]。相似的，拥有蛋白质折叠疾病(Protein folding disease)神经退行性脊髓小脑共济失调3型(Neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 3)的肠隐窝(Intestinal crypts)患者在分化的隐窝细胞而不是干细胞中积累聚集体[24]。

而海洋蜗牛Ilyanassa obsoleta特异性mRNA(编码调节蛋白，例如Tolloid和Dpp)的降解与一个子中心体相关，这证实了不对称细胞命运决定的机制[26]。在线虫和环节动物胚胎的降解过程中，这种细胞机制也参与了核β-连环蛋白的不对称分离[27]，提示这种蛋白降解机制可能参与细胞的不对称的命运，并可能参与T细胞不对称分裂的过程。

4 泛素连接酶不对称分离与子细胞

4.1 泛素连接酶不对称分离的发现 平面细胞极性(Planar cell polarity，PCP)的研究发现一组核心进化上保守的蛋白[包括 Van Gogh/Strabismus(Vang/Stbm or Vangl)，Flamingo/Starry night/Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor(Fmi/Stan/Celsr)，Frizzled(Fz/Fzd)，Dishevelled(Dsh/Dvl)，Prickle(Pk)，Diego/Diversin]在其中起重要作用[28]。并且在大鼠的耳蜗毛细胞中，Celsr1，Vangl2，Dvl1/2和 Fz3/6的突变能破坏静纤毛的方向[29]。重要的是，这些突变展示了严重的神经管缺陷和缩短的前后侧(Anterior-posterior，AP)轴，伴随着扩张的内外侧轴[29]。许多研究发现 PCP蛋白(例如 Dvl、Pk、Vangl和 Diego)是不对称分布的[30]。在果蝇的翅膀中，无论是近端的(Proximal)Vang和Pk，还是远端位于细胞表面的Fz、Dvl和Diego，这些PCP组分形成离散的蛋白复合体。这种PCP蛋白不对称分布的机制仍不清楚。

Smad泛素化调节因子-1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf1)和 Smurf2与 C2-WWHECT类的E3泛素连接蛋白相关，而C2-WW-HECT类的E3泛素连接蛋白在调节细胞信号，细胞极性和细胞运动性中起重要作用[31]。特别是Smurf是极性蛋白Par6的效应因子，通过使RhoA降解调节细胞运动性和极性[32]，并且在上皮间质转化[epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)]过程中，Smurf向Par6以TGFβ依赖的方式招募，来使紧密连接解离[33]。Narimatsu 等[12]发现在大鼠 Smurf1和Smurf2的突变将导致PCP的收敛和伸展运动(Convergence and extension movements，CE)消失，并且Par6-Dvl-Smurf复合体在细胞中是不对称分布的，并与Dvl、Vangl和Pk分布相反。这些研究结果提示，Smurf泛素连接酶在非经典的Wnt途径中起作用，通过调节核心PCP信号途径的组分，引起这些关键的细胞极性因子的不对称分布。

4.2 泛素连接酶不对称分离的机制 蔬菜中的PCP被非经典的Wnt信号和一系列核心的PCP途径组分所调节。Narimatsu等[12]的研究发现，Smurf在哺乳动物中是PCP信号的一个组分，证明Smurf通过Dvl被招募到Par6的非经典的Wnt信号途径调节PCP途径的组分的降解，控制PCP途径的组分Pk1的不对称分布。这种被Smurf泛素连接酶调节的PCP组分的不对称分布，在调节细胞运动和细胞极性上，起重要作用。并且这种机制的存在提示，泛素连接酶的不对称分布可能在调节细胞关键转录因子引起细胞分裂后的子细胞命运决定中起重要作用。这种可能同样会发生在T细胞中。

5 总结与展望

综上所述，UPS系统在细胞内关键蛋白因子的不对称分布中起关键作用，并且提示其对细胞不对称分裂后细胞命运决定的作用。蛋白酶体的不对称分布通过影响T细胞命运关键决定因子的不对称分布，而决定T细胞的命运。提示UPS系统可能参与T细胞的命运过程。而泛素化蛋白的不对称分布对细胞命运的影响，泛素连接酶对细胞内关键因子的不对称分布的影响，都从不同角度提示了UPS对细胞不对称分裂的影响。UPS的不同机制可能参与决定T细胞不同命运。随着UPS对T细胞命运决定的影响的研究，将有助于更深入对T细胞分化的理解，对整个免疫反应的理解，从而对临床上许多免疫相关疾病的治疗提供新的策略。

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