质子泵抑制剂与氯吡格雷联用对大鼠颈动脉血栓形成及血小板活性的影响

郁 琼 张 玉 (复旦大学附属华山医院老年科，上海 200040)

氯吡格雷单用或与阿司匹林联合应用使消化道出血事件明显增加，加用质子泵抑制剂(PPIs)可减少消化道出血的发生风险。随着PPIs和氯吡格雷联合应用增多，近年来关于PPIs对氯吡格雷疗效影响的报道逐渐增多〔1，2〕。同时应用氯吡格雷与PPIs是否增加心血管不良事件的发生风险尚存在争议〔3，4〕。本研究探讨PPIs对氯吡格雷抑制血栓形成及抑制血小板活性的影响，并研究不同剂量奥美拉唑对氯吡格雷疗效影响的量效关系。

1 材料与方法

1.1 材料 6月龄SD雄性成年大鼠，由复旦大学上海医学院实验动物中心提供。氯吡格雷(杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司)，奥美拉唑(常州四药制药有限公司)，埃索美拉唑(阿斯利康制药有限公司)，泮托拉唑(杭州中美华东制药有限公司);ADP(美国Sigma公司);甲基纤维素、FeCl3(国药集团化学试剂有限公司);血小板VASP试剂盒(法国Biocytex公司)。

1.2 实验分组 将60只SD大鼠随机分为空白对照组、单用氯吡格雷组、奥美拉唑低剂量组、奥美拉唑高剂量组、埃索美拉唑组、泮托拉唑组，每组10只。各组药物剂量为氯吡格雷(6.25 mg/kg)、奥美拉唑(10 mg/kg)、奥美拉唑(20 mg/kg)、埃索美拉唑(10 mg/kg)、泮托拉唑(10 mg/kg)。用0.5%甲基纤维素配制PPIs和氯吡格雷悬浊液，每天1次胃内灌注(每350 g大鼠1 ml)，共2 ml，连续7 d。末次服药后1 h将大鼠麻醉，分离左侧颈总动脉用于制备血栓模型，解剖分离腹主动脉取血3～4 ml用于血小板活性检测。

1.3 FeCl3诱导颈动脉血栓模型制作 参照Kurz法改良制作，用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，颈部消毒、剃毛，解剖分离左侧颈总动脉，长度约1.5 cm，在颈动脉下置小片塑料薄膜(2 cm×1.5 cm)，用于保护血管周围组织，配制2.16 mol/L(35%)FeCl3溶液，将吸有20 μl FeCl3溶液的小片滤纸(1 cm×1.5 cm)敷于左侧颈总动脉上，15 min后取下滤纸片，取下滤纸片60 min后，即制作出颈动脉血栓模型。

1.4 血样本采集和处理 取下滤纸片60 min后，腹部剃毛消毒，于剑突下腹正中线打开腹腔，分离腹主动脉，分别从腹主动脉取血1.8 ml到含0.2 ml 3.8%枸橼酸钠的BD抗凝管中，共2管，轻轻摇晃2次混匀待测。1管全血样本制备成贫血小板血浆(PPP)、富血小板血浆(PRP)，用于血小板聚集率的检测，血样本检测必须在收集后2 h内完成。另一管全血样本用于VASP-P程度检测，血样本检测可在收集后24 h内完成。测试前血样本室温(18℃ ～25℃)储存。

1.5 血栓重量测定 取血后迅速切下右侧颈动脉血栓1.5 cm，放于滤纸上吸干残血，用电子天平测定其重量。

1.6 ADP诱导血小板聚集率测定 采用Born氏比浊法，具体步骤如下:①PRP的制备:用3.8%枸橼酸钠抗凝的动脉血1.8 ml以1 000 r/min离心10 min，待离心机自然停止后取出(如出现溶血现象应重新采血)。小心吸取上层血浆即为PRP，移至另一塑料试管并做标志，放置30 min后再进行检测。②PPP的制备:将吸除上层PRP后余下的标本以3 000 r/min离心10 min，再吸取上层血浆即为 PPP，调整 PPP为(10～20)×109/L。③分别吸取PPP和PRP，加入不同玻璃测试杯内，将测试杯置于恒温体的预热孔中预热5 min。④以待测PPP调零后，用PPP调整富血小板血浆至250×109/L，将PPP测试杯取出，继而将 PRP测试杯放入测试孔。⑤将 ADP(终浓度为5 μmol/L)迅速注入PRP测试杯，用血液聚集仪测定最大血小板聚集率(MPAR)。

1.7 VASP-P程度测定 该试剂盒是通过VASP磷酸化状态来检测P2Y12受体的活性。采用流式细胞术，具体步骤如下:①加样:塑料管编号为 T1、T2、T3，T1 加 10 μl PGE1(终浓度10 μmol/L)，T2、T3 加 10 μl PGE1+ADP(终浓度10 μmol/L)，每管加10 μl全血，震荡混匀器低速混匀2 s，室温孵育10 min。②固定:在T1、T2、T3管中各加10 μl 3%多聚甲醛室温下固定，震荡混匀器低速混匀1～2 s，室温孵育5 min。③细胞透化和免疫标记:T1、T2加10 μl抗VASP-P鼠单克隆抗体+透化剂，T3加10 μl阴性同型对照+透化剂，震荡混匀器低速混匀1～2 s，室温孵育5 min。④荧光标记和血小板计数标记:T1、T2、T3管各管加10 μl抗CD61-PE，震荡混匀器低速混匀1～2 s，室温暗处孵育5 min。3管中加2 ml稀释剂后立即置2～8℃冰箱，24 h内上机进行流式细胞分析。⑤流式细胞分析:比较两种测试状态，去评估每个样本中ADP抑制VASP磷酸化的能力。根据静息态(PGE1)和激活态(PGE1+ADP)矫正的平均荧光强度(MFI)计算血小板反应性指数(PRI)，该指数反映P2Y12受体的抑制程度。

1.8 统计学方法采用Stata7.0软件进行数据处理。计量资料以±s表示，两样本间均数的比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验，多样本间均数比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和检验。

2 结果

2.1 PPIs与氯吡格雷联用对大鼠颈动脉血栓形成的影响 氯吡格雷组的血栓重量显著低于空白对照组(P＜0.05)。高剂量奥美拉唑组、低剂量奥美拉唑组、埃索美拉唑组、泮托拉唑组的血栓重量与单用氯吡格雷组相比均无显著差异(P＞0.05)。但高剂量奥美拉唑组的血栓重量显著高于低剂量奥美拉唑组(P＜0.05)。见表1。

2.2 PPIs与氯吡格雷联用对大鼠ADP诱导血小板聚集率的影响 氯吡格雷组的血小板聚集率显著低于对照组(P＜0.05)。高剂量奥美拉唑组、低剂量奥美拉唑组、埃索美拉唑组、泮托拉唑组的血小板聚集率与单用氯吡格雷组相比无显著差异(P＞0.05)。但高剂量奥美拉唑组的血小板聚集率显著高于低剂量奥美拉唑组(P＜0.05)。见表1。

2.3 PPIs与氯吡格雷联用对大鼠血小板VASP-P程度(PRI)的影响 单用氯吡格雷组的PRI显著低于对照组(P＜0.05)。高剂量奥美拉唑组、低剂量奥美拉唑组、埃索美拉唑组、泮托拉唑组的PRI与单用氯吡格雷组相比均无显著差异(P＞0.05)。但高剂量奥美拉唑组的PRI显著高于低剂量奥美拉唑组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组血栓重量、血小板聚集率、PRI结果( ± s，n=10)

与空白对照组比较:1)P＜0.05;与低剂量奥美拉唑组比较:2)P＜0.05

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3 讨论

氯吡格雷是P2Y12受体拮抗剂，通过选择性地与血小板表面ADP受体结合，阻断ADP对腺苷酸环化酶(AC)的抑制作用，促进血管舒张刺激磷蛋白(VASP)磷酸化，抑制纤维蛋白原与其血小板受体GPⅡb/Ⅲa结合而发挥抗血小板聚集作用及抗血栓形成作用。比浊法测定血小板聚集率在临床应用广泛，该方法比较方便、快速，成本低，成为金标准。此法在样品处理过程中需离心，导致部分血小板激活和丢失等;而当血液中的一些大分子物质如脂蛋白、胆红素等增多时会影响血浆浊度，进而影响检测结果，故重复检测变异大。运送过程中如有剧烈晃动，容易造成血小板失活。肝素会影响ADP诱导的血小板聚集率，因其可通过ADP作用于P2Y1受体诱导短暂的血小板聚集〔5〕。所以通过ADP诱导血小板聚集率反映氯吡格雷的抗血小板作用存在一定局限性。VASP检测采用全血，故用血量少、无需离心，不是通过直接检测血小板聚集所以不易受体外血小板激活的影响，具有更好的稳定性和重复性〔6〕。因此，在临床研究中应用中优于血小板聚集率测定。目前，VASP检测临床研究应用较少。

本研究发现PPIs和氯吡格雷联合使用没有增加大鼠颈动脉血栓重量，对血栓形成没有影响。因此认为PPIs对氯吡格雷的抗血栓作用没有影响，不会增加心血管风险。结果与国外前瞻性研究结论一致〔3，4〕。同时本研究发现不同PPIs对ADP诱导血小板聚集率、VASP-P程度没有显著影响，认为PPIs对氯吡格雷抗血小板活性没有影响。然而多项药效学研究发现奥美拉唑显著降低了氯吡格雷的抗血小板活性，埃索美拉唑、泮托拉唑对氯吡格雷的疗效没有影响〔7～9〕，推测PPIs对氯吡格雷疗效影响的机制是由于PPIs和氯吡格雷均通过CYP450酶(主要为CYP2C19、CYP3A4)代谢，PPIs通过竞争CYP450同工酶而影响氯吡格雷转化为活性代谢产物，使氯吡格雷抗血小板活性减弱。奥美拉唑对CYP2C19的亲和力最强。CYP2C19基因多态性也是影响氯吡格雷及其代谢物的药动学和抗血小板活性的重要因素〔10〕。但本研究结果稍有不同，分析可能的原因:①本研究采用动物实验的研究方法，研究对象的同质性较好。研究时避免了其他经CYP2C19代谢的药物的影响。最重要的是排除了冠心病的主要危险因素，如高脂血症、糖尿病、吸烟、肥胖等，这些因素可能会影响血小板聚集功能。②药物往往可以通过两种以上的CYP450酶代谢，当其中一种受抑制时其他CYP450酶的活性可不受影响或代偿性增加，这种情况下药物代谢整体受影响可能不大，如果药物的治疗范围足够大，其效应甚至没有变化。氯吡格雷在肝脏的氧化过程由多个CYP450的同工酶系统参与〔11〕，CYP2C19不是氯吡格雷的唯一代谢活化途径，它可通过其他活化途径(CYP3A4、CYP3A5、CYP1A2、CYP2B6等)代偿。③虽然有药理学研究显示同时应用氯吡格雷与PPIs可降低前者的抗血小板疗效，但是PPIs对氯吡格雷抗血小板疗效的影响可能尚未达到引起临床不良后果的程度。与之相似的阿托伐他汀和氯吡格雷(CYP3A4代谢)的相互作用，有研究表明阿托伐他汀可能会影响氯吡格雷的抑制血小板作用，并没有产生具有临床意义的不良后果〔12〕。④CYP2C19基因多态性不一定会影响氯吡格雷的疗效。O'Donoghue等〔3〕研究显示携带CYP2C19功能缺失的基因与心血管事件风险增加无关(HR=0.76，CI:0.39～1.48)。因此这两类药物的相互作用不一定会对氯吡格雷的抑制血小板活性产生影响。

根据本文结果，笔者推测奥美拉唑对氯吡格雷的影响可能存在一定剂量依赖性，而本项研究剂量尚未达到可显著降低氯吡格雷抗血小板活性的程度。因此建议高剂量奥美拉唑和氯吡格雷联用时仍需谨慎。

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