食管癌肿瘤标记物miRNA的研究进展

杨志平 张 芳 杨志英 盛 望 (北华大学附属医院消化科，吉林 吉林 320)

肿瘤标记物是肿瘤在生长过程中产生和释放某些特定类型的化学物质，可以通过检测其含量来判断肿瘤的存在以及其生长情况，并以此作为诊断标准，疗效评估以及预后判定。肿瘤标记物存在形式有多种，可分为肿瘤细胞分泌物以及肿瘤细胞表达物。microRNA(miRNA)是一类长度约为17～25个核苷酸的非编码单链核糖核酸分子。miRNA在动物体内通过转录后调剂方式作用于靶基因，参与细胞的增殖、分化、代谢、凋亡等过程。近几年的研究发现miRNA表达具有明显的组织细胞特异性，且与肿瘤的发生和发展有着密切联系。Lawrie等〔1〕在检测肿瘤患者外周血的过程中发现miRNA的存在，且发现循环miRNA的表达与肿瘤的发生有一定的相关性，这提示miRNA可作为一种新型的肿瘤标志物。食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，据中国肿瘤登记中心发布的《2012年中国肿瘤登记年报》显示，食管癌肿瘤发病率居第五位，死亡率居第四位。同时其在世界范围内发病率也居高不下〔2〕。miRNA与食管癌的发生发展关系非常密切，通过检测食管癌组织miRNA的表达谱，发现其在正常组织与肿瘤组织中的表达水平具有明显的差异〔3～6〕。通过研究这些不正常的miRNA，将有助于进一步阐明食管癌的发病机制，并将有助于食管癌癌变组织的检测、诊断、治疗以及预后的判断。本文将对作为食管癌肿瘤标记物的miRNA的最新研究进展进行综述。

1 miRNA的形成及其功能

miRNA基因在细胞核内由RNA聚合酶II转录后形成初级转录产物(pri-RNAs)。pri-miRNAs的特征是前段含有一个环状结构，类似发夹，长度约100nt。pri-miRNAs在细胞核内由微处理体协助的一种RNaseⅢ(RNA内切酶Ⅲ)-Drosha及其辅助因子DGCRb的作用下，合成约70个核苷酸长的 miRNA前体pre-miRNAs，通过转运蛋白5(Exportin-5)转运出细胞核至细胞质。在细胞质中，由RNaseⅢ-Dicer酶的作用下将成熟的 miRNA从环结构中剪切下来，加工成19～25个核苷酸长度的成熟miRNA。

成熟的miRNA形成后，在细胞中可以与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)〔7，8〕。RISC 与靶 mRNA 基因不完全配对时，可以阻断miRNA的翻译过程，降低表达;RISC与靶mRNA完全配对时，则可以导致mRNA的降解。miRNA通过阻断或者降解的mRNA表达来控制靶基因的表达，从而达到调控基因的分化、凋亡等一系列的过程。

2 miRNA与肿瘤

肿瘤的发生发展与基因密不可分，环境因素以及遗传等的因素都可以导致或者引起DNA的变化，从而激活原癌基因或引起肿瘤抑制基因的灭活，引起基因表达水平的异常，使靶细胞发生转化。研究发现，超过50%的miRNA基因位于原癌基因/抑癌基因的染色体脆性位点(fragile sites)或相关遗传区域〔9〕。miRNA基因往往在肿瘤中发生异常表达，其在肿瘤的发生发展过程中能够作为致癌因子或抑制因子参与肿瘤的各个过程，对比肿瘤细胞与正常组织细胞间来源的miRNA发现，其表达谱具有明显差异〔10～12〕。因此，其在肿瘤诊断以及判断预后等方面具有重要的参考价值。

2.1 miRNA抑癌基因的作用 Calin等〔13〕人首先发现，miRNA在肿瘤的发生过程中起到抑癌作用。在将近65%的慢性淋巴性白血病，50%的套细胞淋巴瘤患者，16% ～40%的骨髓瘤患者，60%的前列腺癌患者中都有miR-16a和miR-15a基因的缺失或表达下调。而研究表明，miR-15a和miR-16a可以负调控抗bcl-2的表达，bcl-2是miR-15a和miR-16a的下游靶基因，其作为抗凋亡基因参与多种肿瘤的发生过程。miR-15a及miR-16a的表达下调将直接导致bcl-2的过表达，受损细胞正常凋亡程序被破坏，进而导致肿瘤细胞继续复制，从而产生肿瘤。另据研究，miR-143、miR-145在直肠癌、前列腺癌等肿瘤中均呈低表达。miRNAs中的let-7是一类典型的具有抑癌作用的分子家族，Takamizawa等〔14〕研究发现，let-7在肺癌、肝癌患者中呈现低表达，而其对应的靶基因RAS是一种原癌基因出现高表达，可推测出let-7通过对RAS的负调控参与肿瘤的发生发展过程。

2.2 miRNA致癌基因的作用 与正常细胞组织中miRNA的表达相比，miRNA致癌基因在肿瘤细胞中一般会过表达，通过促进细胞的增殖、分化，抑制细胞的正常凋亡过程，从而促进肿瘤的发展。Marilena等〔15〕对六种实体瘤(包括肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌)的miRNA表达谱进行了分析，结果表明miR-21是唯一在所有肿瘤中呈高表达的miRNA。随后，相关研究发现miR-21在头颈部癌、卵巢癌、肝细胞癌和宫颈癌等组织样本和细胞株中表达显著增高〔16～20〕。Hatley 等〔21〕检测了多组食管鳞癌与正常组织中miR-21的表达情况，发现miR-21调控基因及其蛋白过表达，且伴随有淋巴结转移患者表达尤其明显，提示miR-21具有癌基因作用。MiR-155在淋巴瘤组织中表达增高，miR-222，miR-221在甲状腺瘤组织中高表达，这些基因都可导致抑癌基因的活性，可以导致癌症发生。

3 miRNA与食管癌

3.1 miRNA在食管癌中的表达 食管癌是世界卫生组织公布的高发病率的恶性肿瘤之一，越来越多的研究发现食管肿瘤的发生与miRNA有关。目前研究主要集中在miR-21、miR-143、miR-203、miR-375、miR-328、miR-196a、miR-106b-25 等miRNA的异常表达〔22〕。Guo等〔23〕研究了51例食管鳞癌组织中miRNA的表达，与癌旁正常组织中miRNA的表达情况相比，miR-25、miR-424以及miR-151的表达明显上调，而 miR-100、miR-99a、miR-29c和miR-140则表达下调，通过比较miRNA的表达，能够准确区分食管鳞癌和正常组织。Feber等〔24〕在以miRNA表达谱作分子标记物研究食管癌的发生发展过程实验中发现，miR-203和miR-205在食管鳞癌和腺癌中表达低于正常的上皮细胞，而 miR-21、miR-103/107〔25〕在食管鳞癌细胞中与正常粘膜细胞比呈高表达，这些均与食管癌患者存活率不高有关。和正常食管粘膜相比，miR-200c、miR-194和miR-192在食管鳞癌中表达降低，但是在食管腺癌中表达显著上调，表明在不同类型的食管肿瘤中存在 miRNA差异性表达。进一步对miRNA表达谱与食管癌临床病理资料进行分析时发现，miR-335、miR-181d、miR-25、miR-7 以及 miR-495 与食管癌大体分类有关，而miR-25、miR-130b则和食管癌的高中低分化有关，同时还发现某些与食管癌患者的预后相关。陆续的研究也发现miRNA的异常表达与食管癌有关，且可能作为食管癌诊断的分子标志物。miR-373在食管鳞癌中过表达，发挥致癌基因作用，通过抑制下游靶标抑癌基因 LATS2的表达参与食管鳞癌的发生〔26〕。而miR-196a则可抑制annexin A1(ANXA1)的表达，ANXA1是抑癌基因，具有抑制细胞增殖和促进凋亡的作用，miR-196a通过抑制ANXA1的表达进而引发食管癌〔27〕。

3.2 miRNA在食管癌的检测、诊断与治疗 食管癌肿瘤细胞以及癌旁正常组织中miRNA的表达量存在差别，通过检测两者的表达情况可以预测食管癌的发生发展过程，还可以对癌症进行分级评估以判定肿瘤转移程度，为预后作出相关指示。食管癌miRNA的检测方法主要是通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)来进行，此方法精确度与灵敏度较高，可以实时监测miRNA的转录情况，被越来越多的研究者采用。Hiyoshi等〔28〕通过RT-PCR和原位杂交技术研究了21例食管鳞癌组织以及癌旁正常组织中miR-21的表达情况，结果显示，与正常组织细胞相比，肿瘤细胞中miR-21的表达明显显著上调，进一步的分析发现，miR-21可能负调控一种抑癌基因-细胞程序性死亡基因4(PDCD4)。除检测正常组织与肿瘤组织中miRNA的表达情况外，还可以检测血清miRNA。血清中存在大量稳定的miRNA，其表达结果也存在显著的差异，提示可以用来作为检测肿瘤的标记物。Kurashige等〔29〕检测了71例食管鳞癌患者与39例正常人中miR-21表达情况，结果显示 miR-21在所有食管鳞癌样本中高表达，而在对照组中物明显变化，患者术后的血浆中miR-21表达水平显著下降。Akagi等〔30〕研究也证实了miR-21和miR-205在食管鳞癌组织中的高表达，且伴随有肿瘤细胞侵袭和淋巴结转移的患者表达更明显，证明某些特定的miRNAs与食管鳞癌的侵袭性呈正相关。而miR-143和miR-145却在食管鳞癌细胞中表达出现下调，可以影响到肿瘤细胞的迁移过程，其与肿瘤的侵袭性呈负相关〔31〕。

食管癌的临床治疗方法主要有手术、化疗和放疗等方法，但是由于上述方法存在疗效差，预后困难等问题。miRNA在肿瘤细胞的分化、增值、凋亡过程中具有组织特异性，其在正常组织与肿瘤组织中表达量具有明显的差异。通过对miRNA靶基因的表达控制则可以很好解决，基因治疗成为人们研究的重点。目前，常用的食管癌基因治疗方法是通过内源性或外源性的双链RNA(ds-RNA)将RNAi导入细胞，RNAi是一种基因沉默工具，经核酸酶Ⅲ(RNase III)剪切成siRNA，经特异性的核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等形成RISC引起同源miRNA降解，可以抑制相应靶基因的表达。而在肿瘤组织中起癌基因作用的miRNA，则可以通过使异常miRNA沉默导致抑癌基因表达恢复正常，通过干扰癌基因的表达而达到治疗目的。Sugito〔32〕研究发现，食管癌低RNASEN表达组发生淋巴结转移比高表达组低。RNASEN含有两个RNaseⅢ的结构域和一个双链RNA结合域，而RNaseⅢ是miRNA合成过程中重要的酶。可通过下调RNASEN表达，减少相关miRNA的合成，进一步影响miRNA相关靶mRNA表达，减缓肿瘤的转移，延长术后生存时间。基因治疗的重点是找到肿瘤相关的特异miRNA，目前在基因的靶点预测方面还存在很大的困难，建立食管癌相关miRNA的表达谱系，将miRNA与食管癌肿瘤的关系进一步明确，miRNA在食管癌的治疗方面将会有更大的进展。

4 展论

miRNAs作为一种新型的肿瘤标记物已经引起了人们的极大关注，同时也给与了极高的希望。目前，人们已经对miRNAs的基本结构及其生物学功能有了初步的了解。miRNAs在食管癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中发挥了重要的作用，但其调控机制尚未得到完全阐明。miRNA在食管癌的诊断、治疗和预后中有巨大的利用价值。通过寻找调控miRNA的基因及其靶基因，探寻其作用机制，相信在不久的将来我们能够研发出相应的靶点药物，为肿瘤疾病的治疗带来新的机遇。

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