异尖线虫病诊断技术研究进展

周 洋，陈家旭，蔡玉春

异尖线虫病（anisakiasis）是由于人食用生的或未煮熟的含异尖线虫Ⅲ期幼虫的海鱼所导致的一种鱼源性寄生虫病[1]。20世纪60年代首次报道人异尖线虫病以来，已在全球五大洲均有病例报告，其中大多数病例是来自日本、西班牙等有食生鱼习惯的国家。日本每年有2 000例异尖线虫病，美国50例，欧洲500例[2]，而且随着人们生食海鱼习惯的盛行，异尖线虫病呈逐年增加趋势。

目前临床上确诊异尖线虫病的主要方法仍是以纤维内窥镜检查在胃内发现虫体为主[3]，但对肠道及组织器官内的不典型异尖线虫病的诊断存在较大困难。故实验室和临床上对异尖线虫病的诊断技术做了很多的尝试和研究。现就异尖线虫病的病原学、影像学、免疫学及分子生物学的诊断检测技术现状和进展综述如下。

1 病原学诊断方法

1.1 纤维内窥镜检查 纤维内窥镜检查是胃异尖线虫病最有效的诊断方法。胃异尖线虫病发病急骤，可在食用生鱼后的1～2个h后突然发病，引起腹部急性疼痛、恶心、呕吐等症状。Namiki[4]1968年首次使用纤维内窥镜在一病人胃部查到异尖线虫虫体，并成功将虫体从胃部取出，起到了治疗作用。Zullo等[5]对一名上腹部疼痛有食生鱼史的病人进行纤维内窥镜检查，在胃壁上见到活的异尖线虫Ⅲ期幼虫（L3幼虫），取出虫体后症状消失。Konosuke[6]和 Yoshihiko[7]也通过纤维内窥镜检查腹部剧烈疼痛并有食生鱼史的病人，发现胃壁上有活动的L3幼虫，胃粘膜上有糜烂、水肿等病理变化，被确诊为异尖线虫病。David等[8]报道一例腹部持续刺痛并伴有恶心呕吐的病人，对其进行上消化道内镜检查，发现十二指肠球部有两个直径为10mm的溃疡，距其5mm处有一白色线虫正在穿过十二指肠粘膜，取出虫体后症状迅速改善，4w后溃疡完全愈合。内窥镜检查不仅可以用于异尖线虫病确诊的主要技术方法，而且还可用于治疗胃异尖线虫病的重要手段和工具。

1.2 病理组织学检查 异尖线虫病引起的病理组织学特征主要是以粘膜下层为中心的伴有大量嗜酸粒细胞浸润的蜂窝组织炎和嗜酸性肉芽肿。Montalto等[9]报道一例急性腹部疼痛的病人组织切片的观察，发现虫体切面，其周围嗜酸性粒细胞增多，且有食生鱼史，故推断为由异尖线虫Ⅲ期幼虫引起的胃肠炎。R.Pezzilli等[10]诊断一例上腹痛的病人时，考虑其为胰腺癌或者为胰腺炎，故对其进行手术，后通过对其病例组织切片的观察，发现虫体断面，证实该患者为异尖线虫病。黄维义[11]用异尖线虫L3感染大鼠试验证实，大鼠初次感染的病理变化以胃壁水肿、充血、出血等异物反应为特征，再次感染以过敏反应引起的大量嗜酸性粒细胞浸润造成急性蜂窝组织炎以及肉芽组织包围虫体形成的肿块为特征。

2 影像学检查

2.1 X线检查 胃异尖线虫病的X线征主要呈纵向胃壁皱折肿胀（81%），有时可见幼虫本身呈线形的阴影（48%）[12]。对于肠异尖线虫病，钡餐后肠X线征为钡剂的进行呈分节状，患部可见锯齿状或短棒状阴影，患部上方的肠管有较强的扩张，其中滞留的钡剂可见颗粒状阴影。超声影像也可用以辅助诊断肠异尖线虫病[13]。

2.2 CT检查 Hye Jin Yoo等[14]通过 CT结肠成像诊断一例结肠癌同时伴结肠异尖线虫病例，CT结肠成像的多平面重组图像显示肠壁增厚，乙状结肠肠腔狭窄，表面遮盖图像显示，乙状结肠如苹果核样向心性狭窄。实施结肠切除术后，对其进行病理组织切片观察，发现升结肠段有非常明显的嗜酸性粒细胞渗透，粘膜下层有非常多的异尖线虫虫体断面。Masaharu[15]通过CT扫描联合组织病理学切片观察，诊断了3例肠异尖线虫病，观察到肠腔膨大，有积液，显示出凹陷性影像。小肠局部切除术后，对其组织进行病理切片检查，发现异尖线虫穿透肠壁，肠腔周围嗜酸性粒细胞增多。表明CT扫描是一种有效的辅助诊断异尖线虫病的工具。

3 免疫学诊断技术

近年来，随着免疫技术的快速发展，酶免疫印迹技术和酶联免疫吸附试验等免疫学技术因其敏感性高、特异性强、操作简便等优点，作为检测异尖线虫的主要免疫学方法。且对在胃内和小肠内不能发现幼虫的情况下，免疫诊断就显示出它独有的优势。

3.1 诊断用抗原

3.1.1 排泄分泌抗原 Akao等[16]以异尖线虫Ⅲ期幼虫排泄分泌抗原（Excretion－secretion antigen，ES）作诊断抗原，采用免疫印迹的方法检测病人血清中特异性IgG、IgA、IgE抗体情况。结果显示，在9例确诊为异尖线虫病的病人血清检测中，IgG阳性者3例、IgA阳性者5例、IgE阳性者6例。抗原反应条带集中在50kDa－120kDa范围内，排泄分泌抗原对IgA和IgE抗体的特异性高于IgG。Iglesias等[17]采用体外培养法，收集异尖线虫Ⅲ期幼虫排泄分泌抗原和虫体抗原（Somatic antigen，SA），SDS－PAGE结果显示，L3期幼虫的SA主要蛋白条带分布在13kDa－150kDa，ES主要蛋白条带分布在14kDa－60kDa；L4期幼虫的SA主要蛋白条带分布在14kDa～150kDa，ES主要蛋白条带分布在55－120kDa。运用 Western blot方法检测异尖线虫感染小鼠血清，对比观察ES和SA抗原的反应条带的异同。结果发现感染鼠血清识别ES抗原和SA抗原的条带不同，识别L3期幼虫ES抗原的16，24，27，31，55，62kDa等条带，识别 L4期幼虫的 ES抗原条带较多；而感染鼠血清仅识别L3期幼虫SA抗原的22，27，67kDa等条带，在L4期幼虫SA抗原37kDa处有明显的条带。表明ES抗原作为诊断用抗原优于虫体抗原。

3.1.2 纯化抗原 Rodero等[18]应用异尖线虫Ⅲ期幼虫和蛔虫抗原免疫的兔血清，分别进行琼脂糖凝胶CL－4B亲和柱层析，分离出特异性的抗异尖线虫IgG和抗蛔虫IgG。再用亲和层析的方法，纯化异尖线虫Ⅲ期幼虫粗抗原。进行 Western blot，纯化抗原与粗抗原相比，筛选出205，120，66－45，40，31－21和14kD等反应较清晰的纯化条带。Rodero[19]用异尖线虫粗抗原（CE）、用抗异尖线虫IgG亲和层析纯化的幼虫抗原（PAK）、蛔虫成虫粗抗原（EAS）以及抗蛔虫IgG亲和层析纯化的幼虫抗原（PAS）对20例病人进行皮肤点刺试验的对比，结果显示抗蛔虫皮肤点刺试验的阳性率为35%，低于抗异尖线虫抗原检测的阳性率57%。两种粗抗原阳性反应性弱于两种纯化抗原阳性反应性。但在Rodero2005年其发表的论文中[20]用异尖线虫Ⅲ期幼虫粗抗原和抗异尖线虫IgG亲和层析纯化的幼虫抗原与异尖线虫病人及感染其他寄生虫病的病人的血清反应，则只有血吸虫和旋尾丝虫病人的血清不与异尖线虫抗原反应，说明交叉反应严重。

Kobayashi等[21]利用葡聚糖凝胶过滤层析从简单异尖线虫Ⅲ期幼虫纯化出一种新的热稳定性良好的虫体抗原，分子量为15kDa，命名为Ani s 8。通过荧光ELISA显示，28份异尖线虫病患者血清中有7份血清IgE水平升高，通过cDNA克隆阐述了Ani s 8的完整氨基酸序列。

3.1.3 重组抗原 纯化抗原使免疫诊断变得可靠，而重组抗原则可使免疫诊断方法标准化的进行，使抗原制备变得简单并能大批量生产。Ani s 1是异尖线虫引起过敏症的主要抗原，且用ELISA方法检测抗Ani s 1的IgE来诊断异尖线虫病有较高的特异性[22]。Ibarrola等[23]用重组的 Ani s 1抗原和天然的Ani s 1抗原与53例异尖线虫病患者的血清进行反应，结果显示其敏感性和特异性均较高，分别为86.8%和90%。和天然的Ani s 1抗原的检测结果相一致，但由于天然抗原的提取和纯化需要大量的异尖线虫且提取量较小，不能满足常规化的检测，故运用重组抗原有现实意义。

使用重组抗原可以提高血清诊断的效率，Anadón等[24]为对比重组 Ani s 1和 Ani s 7ELISA法的诊断和临床价值并与UniCAP 100的检测效果相比较，用495名异尖线虫病患者和25名其他疾病患者进行试验，重组Ani s 7ELISA和Ani s 1ELISA的敏感性分别为94%和61%。抗异尖线虫IgE抗体可检测重组Ani s 1的血清水平持续的时间更长，可用于检测慢性异尖线虫病。且认为抗IgE抗体的重组Ani s 1和Ani s 7抗原是目前血清诊断人异尖线虫病最好的选择。

Gamboa等[25]研究重组Ani s 1和重组Ani s 3两种异尖线虫抗原的诊断价值，用皮肤点刺试验、嗜碱性粒细胞活化试验（basophil activation test，BAT）和特异性IgE检测等方法来作鉴别，选取25名异尖线虫病患者，17例遗传性过敏患者、10例有急性荨麻疹，皮肤点刺试验阳性和特异性IgE阳性的人为对照。结果显示rAni s 1抗原其皮肤点刺试验的敏感性和特异性为100%，特异性IgE的敏感性和特异性为100%，嗜碱性粒细胞活化试验检测显示敏感性为96.8%和100%。

Sugane等[26]就通过构建异尖线虫Ⅲ期幼虫cDNA文库并筛选阳性克隆表达的蛋白，选定分子量为42kDa的蛋白进行Southern和Northern blot分析，与其他寄生虫病感染血清无交叉反应。Caballero[27]通过免疫筛选用异尖线虫Ⅲ期幼虫构建的cDNA文库得到一个新的分子质量为22kDa的蛋白抗原，命名为Ani s10，与其他过敏源蛋白没有同源性，对77位有异尖线虫病患者进行检测，其中30位对rAni s 10和nAni s 10反应为阳性，说明Ani s 10对于诊断异尖线虫病是有效的。获得抗原的cDNAs不仅筛选出用于诊断的重组抗原，也可为研究抗原特异性诊断技术提供依据。Kobayashi等[28]用此技术发现了 Ani s 11、Ani s 11－like protein和Ani s 12 3个抗原。

3.2免疫诊断方法

3.2.1 皮肤点刺试验 Ventura等[29]通过如下3种处理方式来制备异尖线虫L3幼虫抗原：100。C煮沸10min、－24。C冷冻48h、2～4。C保存。研究10位有简单异尖线虫过敏症状的病人进行皮肤点刺试验（skin prick test，SPT），结果用这3种处理方法的幼虫做皮肤点刺试验，其阳性率分别为70%、70%、100%。Rey－Moreno等[30]进行皮肤点刺试验检测134例急性腹痛患者，52例异尖线虫病患者和82例为其他疾病患者。结果显示皮肤点刺试验的敏感性87.5%，特异性95.6%。

3.2.2 ELISA ELISA法由于其高的敏感性和特异性，而在诊断异尖线虫病中成为必要的诊断方法。可用于易感人群的筛查。Hyun－Jong Yang等[31]建立异尖线虫L3幼虫感染兔动物模型，收集第6d到第96d的血清，用粗抗原包被的ELISA板检测血清中的IgM和IgG抗体，结果显示抗体IgM的水平从感染后第6d开始上升，第11d达到高峰，其后逐渐降低。抗体IgG水平则在第26d达到高峰，之后逐渐下降。

Amano等[32]检测1、5、20条异尖线虫 L3幼虫感染Wistar大鼠后，血清中特异性抗体的情况。通过ELISA法观察大鼠体内抗体的滴度变化。感染5条或20条L3幼虫大鼠体内的IgM抗体水平在第21d达到顶峰之后快速下降，而感染1条L3幼虫的大鼠体内IgM抗体水平在第8d就到顶峰，之后快速下降。而IgE抗体水平在第12d达到高峰，且浓度随着感染L3幼虫条数的增加而增加。

3.2.3 Western blot Hyun－Jong Yang等[31]等将异尖线虫L3幼虫粗抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），至少有41条蛋白条带被识别。再应用异尖线虫感染阳性兔血清进行Western blot实验，IgM 抗体反应的条带有168、95、74、64、51、47、34kDa，而IgG抗体反应强烈的条带有168、92、85、64、58、52、42kDa。且和其他寄生虫病血清交叉反应小。Jung Kim等[33]对韩国南部3所医院的进行健康检查的住院医生，检测其异尖线虫L3幼虫血清阳性率。粗抗原和排泄分泌产物IgE－ELISA和IgE－western－blot法共检498份样本。结果粗抗原和排泄分泌产物ELISA法抗体阳性率分别为5.0%和6.6%。对10份抗体检测结果阳性的检查者的血清进行，粗抗原和排泄分泌产物western－blot发现，均发现在130kDa处特异性的条带，认为可作为诊断异尖线虫病血清阳性率的候选抗原。免疫印迹法即Western blot法，不但用于检测异尖线虫病的有无，而且还应用于寻找特异性抗原，使其应用于检测异尖线虫病，提高检测效率。

4 分子生物学诊断方法

Mattiucci等[34]对从肠道异尖线虫病人体内移除的，用福尔马林浸泡过的肉芽肿瘤组织进行分子鉴定，利用629bp mtDNA cox2特异性引物进行扩增，得到的序列与GenBank中的序列进行比对，鉴定为派氏异尖线虫。D｀Amelio等[35]利用纤维内窥镜检查得到的幼虫样本进行PCR－RFLP分子鉴定，证明该患者为派氏异尖线虫感染，同时证明PCRRFLP是一种成本效益好、可靠的鉴定异尖线虫幼虫的工具。张少雷等[36]运用荧光定量PCR法检测鱼类内脏中检获6种异尖线虫类幼虫：抹香鲸异尖线虫、简单异尖线虫等，提取各虫体DNA，PCR扩增ITS－2序列，测序并进行数据库比对，鉴定的虫种与形态学初步鉴定结果完全一致，且与常规的PCR相比具有更高的敏感性和特异性，且具有无污染、可定量、耗时短等优点。郑洋妹[37]等建立了一种快速鉴定简单异尖线虫的环介导等温扩增方法，根据简单异尖线虫ITS保守区域的基因序列设计特异引物进行LAMP扩增，得出最佳反应体系为0.8 mmol／LdNTPs、10mmol／LMg2＋、0.8mmol／LBetaine和0.2μmol／L外引物、1.6μmol／L内引物；检测简单异尖线虫的灵敏度达到10拷贝／μl；与其他线虫无交叉反应；7份简单异尖线虫样品经LAMP验证均为阳性。说明LAMP法灵敏度高特异性强，且操作简便、成本低，是鉴定简单异尖线虫的有效手段。

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