叶绿素荧光分析技术在水稻研究中的应用

黄光福，唐巧玲，唐云鹏，赵丽萍，唐启源

(湖南农业大学农学院，长沙410128)

水稻是全世界重要的粮食作物，占全球谷类作物种植面积的1/3，为人类提供40%的热能。为了满足日益增长的人口对粮食作物的需求，必须不断提高水稻产量，但是栽培过程中，水稻容易受到逆境胁迫，严重影响产量的提高，因此选择简单、快捷和精确的方法对水稻进行逆境胁迫的研究具有重要意义。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与表观性的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有内在性的特点。近年来随着叶绿素荧光理论和测定技术的进步，大大推动了光合作用超快原初反应及其他有关光合机理的研究［1，2］。目前，叶绿素荧光分析技术应用于光合作用机理、植物抗逆生理和作物增产潜力预测等方面的研究已取得一定进展，并且愈来愈多的研究表明，植物体内发出的叶绿素荧光信号包含了十分丰富的光合作用信息，其特性与植物的营养和受胁迫程度密切相关，可以快速、灵敏和无损伤地研究和探测完整植株在胁迫下光合作用的真实行为，经常被用于评价光合机构的功能和环境胁迫对其的影响，因此，通过植物光合过程中荧光特性的探测可以了解植物的生长、病害及受胁迫等生理状况［3，4］。目前，基于叶绿素荧光分析技术的各种优点，此技术在水稻温度胁迫、水分胁迫、营养元素胁迫、突变体研究和外源物质对水稻逆境胁迫影响等领域已得到广泛的应用。

1 叶绿素荧光的产生

叶绿素荧光是叶绿素分子吸收光量子由处于激发状态通过向平衡状态转化而产生的一种主要光信号。细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子或间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后，从基态跃迁到激发态。由于波长越短能量越高，故叶绿素分子吸收红光后，电子跃迁到最低激发态;吸收蓝光后，电子跃迁到比吸收红光更高的能级。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，在几百飞秒内，通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态。最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒。处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态。能量的释放方式有如下几种:1)重新放出一个光子，回到基态，即产生荧光。由于部分激发能在放出荧光光子之前以热的形式逸散掉了，因此荧光的波长比吸收光的波长长，叶绿素荧光一般位于红光区。2)不放出光子，直接以热的形式耗散掉(非辐射能量耗散)。3)将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶绿素分子，能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后到达反应中心，反应中心叶绿素分子通过电荷分离将能量传递给电子受体，从而进行光化学反应。以上这3个过程是相互竞争的，往往是具有最大速率的过程处于支配地位。对许多色素分子来说，荧光发生在纳秒级，而光化学发生在ps级，因此当光合生物处于正常的生理状态时，天线色素吸收的光能绝大部分用来进行光化学反应，荧光只占很小的一部分。荧光的波长一般要比激发光的波长长，激发光与荧光不会重合［5］。当叶片吸收红光时，叶绿素分子中的电子从基态跃迁到最低激发态，这时电子处于不稳定状态，又会释放荧光回到基态。当叶片吸收蓝光时，叶绿素分子中的电子会直接从基态跃迁到较高激发态，这时的电子为了回到基态寻求稳定，以热辐射的形式耗散能量到达最低激发态，然后再以荧光的形式耗散能量到达基态。荧光的变化与叶绿素的浓度成正比，与光合效率成反比［6］。人们也称叶绿素荧光诱导现象为Kautsky效应。在正常的生理学温度下，接近95%的被检测到的叶绿素荧光信号来源于PSⅡ相关的叶绿素分子，PSⅠ色素系统基本不发荧光。所以研究叶绿素荧光光谱主要针对PSⅡ相关的叶绿素分子发射出的荧光［7］。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线划分为荧光上升阶段和荧光猝灭阶段，反映出绿色植物材料经过暗适应后转到光下时，其体内叶绿素荧光强度随时间变化的规律。

2 叶绿素荧光分析技术在水稻研究中的应用

2.1 温度胁迫

2.2.1 低温胁迫

水稻在温度低于10～12℃时就会表现出冷害症状［8］。冷害可对水稻整个代谢和生理过程造成不可逆伤害。低温引起类囊体膜介导的光反应活性降低［9］，使类囊体膜上的PSⅡ的光能传递效率和光能转换效率降低［10］，从而导致CO2同化能力降低，而光反应活性较暗反应活性对低温伤害更敏感［9］。水稻幼苗低温胁迫处理后，PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)降低，非光化学淬灭系数(qN)均升高，PSⅡ最大相对电子传递速率(rETRmax)、半饱和光强(Ik)均下降、最大光合速率(Pmax)和原初光化学效率(Fv/Fm)下降，最终导致水稻幼苗的光合能力下降［11，12］。

2.2.2 高温胁迫

在水稻的温度逆境胁迫研究中，高温胁迫后水稻叶片和水稻黄叶剑叶突变体的PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)、PSⅡ线性电子传递的量子效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭系数(qP)、非循环光合电子传递速率(ETR)和净光合速率(Pn)下降，PSⅡ的相对还原状态(qP)升高，初始荧光(Fo)和非光化学淬灭系数(qN)升高，qP在灌浆早期最低，灌浆后14 d升至最高，然后逐渐降低。灌浆结实后期Fv/Fo(PSⅡ的潜在活性)和Fv/Fo(最大光化学量子产量)的下降速率最快［13～17］。高温下抽穗期、乳熟期水稻剑叶Fv/Fm的下降幅度和Fo的上升幅度比蜡熟期、完熟期大［18］。高温下叶绿素荧光的变化说明了水稻的光系统(主要是PSⅡ)在高温下受到损伤，光能吸收和传递的效率降低，热耗散增加，从而影响到后续的光合电子传递过程及光合磷酸化［19］。

2.2 光氧化影响

2.2.1 光氧化对叶片光合速率的影响

长时间的光抑制会引发光氧化的发生，甚至导致叶片死亡。有研究表明，光氧化条件下，PSⅡ反应中心受到破坏或发生失活，表现为水稻叶片Fo显著升高，Fv/Fm和Fv/Fo降低，因此抑制光合作用的主要因素是PSⅡ部分失活、气孔部分关闭和关键酶类氧化失活［20，21］。在光氧化条件下，水稻光合机构中PSⅡ的D1蛋白量下降，导致PSⅡ反应中心结构变化，进而导致PSⅡ反应中心功能丧失，引起光合电子传递的受阻，从而抑制光合作用的正常进行。同时，在光氧化条件下，保护PSⅡ的叶黄素循环组分中环氧玉米黄质和玉米黄质的形成受抑，PSⅡ光化学效率和非光化学猝灭明显下降。随着活性氧的积累，光合电子传递活性不断下降［22～25］。

2.2.2 光氧化对叶片光合酶的影响

对光氧化敏感的水稻品种，遭受光氧化条件时，PSⅡ和Rubisco活性均有明显下降，因而光合速率也降低;而耐光氧化品种的PSⅡ和Rubisco活性相对稳定。耐光氧化品种的Fv/Fm变化与PSⅡ活性下降较少［26］。

2.3 水分胁迫

水分是植物生长发育的主要限制因子，水分不足显著影响光合作用的进行。受涝下水稻抽穗开花期叶绿素荧光参数均随着光照变化存在明显的日变化规律，在中午发生光抑制现象。水稻一定程度的受涝，可以缓解光抑制现象，甚至出现补偿效应;过度受涝会使水稻的光合机制严重受损［27］。水稻的呼吸作用和光合作用对水分胁迫的敏感性均随水分胁迫程度的增加而增大。随叶片水势下降而发生光合速度变慢，叶片净光合速率下降［28］。水稻受轻旱，对光合作用的影响不明显，严重干旱时叶绿素含量、叶绿素荧光参数Fv/Fm及Fv/Fo显著降低，光合作用受到明显抑制［29，30］，而荧光诱导动力学参数与作物品种的抗旱性有密切的关系［27］。

2.4 养分胁迫

2.4.1 氮素胁迫

改善高氮条件对荧光参数的协同调控效果，积极探索氮素营养对荧光参数协同改善的途径，对提高作物的光合速率具有十分重要的意义［31］。在低肥状态下，超绿水稻的Fm、Fv/Fm和Fv/Fo仍然能保持较高水平。超绿水稻的光合速率受氮肥影响较小，在较低的氮肥水平下仍具有较高的光合速率，这种特殊水稻种质对于提高水稻的氮肥利用效率可能具有重要作用［32］。

2.4.2 钾素胁迫

水稻缺钾胁迫处理后光下可变荧光与最大荧光比、光化学猝灭系数(qP)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)以及光合电子传递速率(ETR)和光饱和点均有所下降，且随叶位的降低，净光合速率(Pn)、PSⅡ最大光化学量子产量(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学量子产量(ΦPSⅡ)、表观电子传递速率(ETR)均显著下降。缺钾对各水稻品种叶绿素荧光参数的影响与其钾敏感性密切相关，所以叶绿素荧光参数可作为快速筛选耐缺钾水稻品种的参考指标，同时NPQ显著上升，说明钾胁迫下的水稻叶片可以通过启动热耗散机制耗散过剩的激发能，进而保护光合机构免受伤害［33～35］。

2.4.3 其它元素

低温下磷营养充足时水稻叶片具有较高的叶绿素含量、光合速率、光化学效率Fv/Fm和光化学猝灭系数qP。磷营养水平对冷敏感品种光合作用的影响比对耐冷品种更明显，所以通过体外施磷，可以提高水稻的耐冷性［36］。锌营养能减轻水稻幼苗因盐胁迫造成的叶片光合机构的破坏程度，提高PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)，有效光化学效率及PSⅡ电子传递量子效率，并提高电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)，减小非光化学猝灭系数(NPQ)，以达到提高光能利用率的目标［37］。缺硫情况时，水稻叶片的净光合速率(Pn)、初始荧光(Fo)、光化学效率(Fv/Fm)、有效光化学效率、实际光化学效率ФPSⅡ和电子传递速率(ETR)显著下降，非光化学能量耗散(NPQ)增加，整体光合能力降低。PSⅡ反应中心破坏或可逆性失活没有造成水稻叶绿素PSⅡ活性降低，而非光化学能量耗散增加造成了缺硫水稻Fo下降，这很可能是水稻植株适应缺硫逆境的一种机制［38］。施硅后水稻的叶片硅含量均显著上升，水稻植株的抗旱性明显增强［40］。镉胁迫下随着镉浓度增加水稻净光合速率(Pn)、光化学效率Fv/Fm、光化学猝灭系数qP和非光化学猝灭系数qN均有所下降，低浓度镉胁迫下水稻充分启动了能量耗散途径，耗散了过剩光能，保护光合机构。高浓度镉破坏水稻光合结构，光合速率下降［40，41］。

2.5 盐胁迫

盐胁迫是影响植物光合作用的逆境因素之一。高浓度盐胁迫会引起植物水分平衡的紊乱、降低膨压、限制生长，也会引起气孔关闭、降低CO2的固定率、降低光能吸收与转换［42］。在一定范围内水稻幼苗随着NaCl胁迫浓度和时间的增加，初始荧光、最大光化学效率、表观电子传递速率、光量子产量和光化学猝灭系数不断下降［43］。高浓度NaCl的胁迫，使植物更易受到光抑制［44］。

2.6 物理胁迫

有效紫外线B辐射增加，会严重影响水稻光合过程［45］。特别是光系统Ⅱ反应中心，引起光合电子传递效率下降，叶绿素a荧光诱导动力学参数改变，光系统Ⅱ活性受抑制，光合作用效率降低。硅质体的累积特性可能是水稻对UV－B辐射胁迫的适应机制之一［46］。高臭氧浓度降低了水稻叶片的净光合速率，荧光动力学参数Fo(暗下初始荧光)、ETR(表观电子传递速率)、最大光量子效率(Fv/Fm)、实际光量子效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭(qP)和ФPSⅡ呈下降趋势，NPQ 则逐渐上升［47，48］。

2.7 水稻突变体的研究

水稻黄叶突变体的光合速率(Pn)、PSⅡ原初光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ光量子效率(ФPSⅡ)、非循环光合电子传递速率(ETR)和热耗散(NPQ)均高于野生型，突变体对强光光响应能力优于野生型亲本［49，50］。40℃高温胁迫致使水稻黄叶突变体剑叶叶绿体超微结构破坏，引起PSⅡ反应中心的光化学效率降低，最终造成叶片光合能力减弱［18］。突变体通过减少热耗散和提高光合电子传递速率来提高光能利用效率，光反应和暗反应的协同使突变体具有较高的光合速率［51］。水稻白色条纹突变体与野生型相比，突变体单位重量叶片叶绿素含量显著下降，但叶绿素光能吸收强度略有上升。突变体保持叶片光合效率稳定的机制是通过提高胡萝卜素与叶绿素比值来补偿光合色素含量和激发能的降低引起的光合效率下降［52］。

2.8 外源物质对水稻逆境胁迫的影响

干旱胁迫下外源茉莉酸甲酯处理可显著提高水稻幼苗的抗旱性［53］。外源甜菜碱可明显增强水稻对盐胁迫的抗性［54］。甲基紫精轻度胁迫引起光系统Ⅱ(PSⅡ)活性的下调和可逆失活，可以使光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(qN)增加，严重胁迫使PSⅡ功能和结构受到伤害，抑制了光合作用［55］。孙磊利用叶绿素荧光分析技术得出喷施壳聚糖可增强水稻幼苗的抗冷性［56，57］。

3 展望

叶绿素荧光动力学技术实现了在现场或自然条件下，以完整植株或含有叶绿素的部分器官为材料，测定和研究光合作用动态变化，以及灵敏地探测各种外界因子对水稻光合作用的影响。同时，该技术具有灵敏、简便、快速和无损伤检测等优点，使它迅速在水稻各种抗性生理、突变体等研究中得到广泛应用。研究表明，环境胁迫的程度与水稻体内Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、Rfd、qP、qN 和 Yield 等参数的受抑制程度呈显著相关，可作为水稻抗逆的指标。叶绿素荧光分析技术具有诸多优点，在以后可以加强以下几方面的研究:1)体内不同种类的荧光究竟是由PSⅡ系统哪一种复合体发射的，以及发射荧光复合体与其荧光的关系，荧光参数之间的关系及机理;2)加强叶绿素荧光分析技术相应分析软件的研制，提高仪器灵敏度;将叶片的吸收光谱、光合放氧、二氧化碳固定等相结合，形成一种多功能综合性的检测研究手段;3)加强叶绿素荧光技术在水稻逆境胁迫和抗性的机理研究;4)将叶绿素荧光分析技术应用在水稻生产实践中，与遥感技术等相结合，监测水稻各时期的生长状况。可以预见，随着叶绿素荧光理论研究的深入和探测分析技术的进一步发展，荧光分析技术将会在水稻研究中得到越来越广泛的应用。

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