转化生长因子 β 与 microRNAs 的串话效应在心肌纤维化中的研究进展

杨四宝、高永建综述，杨萍审校

转化生长因子 β 与 microRNAs 的串话效应在心肌纤维化中的研究进展

杨四宝、高永建综述，杨萍审校

心脏重构是心力衰竭发生的根本原因，其中心肌纤维化伴随着心力衰竭发生发展的全过程。转化生长因子 β（TGFβ）是重要的促纤维化因子，在病理情况下可通过经典的 TGFβ- Smads 通路诱导心肌纤维化的发生发展，并最终导致心力衰竭。MicroRNAs 是 11～25 个核苷酸长度的单链非编码小 RNAs，可在转录后水平调节基因表达，从而导致疾病的发生。TGFβ 通路可在转录和转录后水平调节纤维化相关 microRNAs 的合成和表达，而 microRNAs 则可在多水平对 TGFβ 通路及其下游基因编码蛋白进行反应性调节，二者之间存在着精细的自身反馈调节系统，作者将二者之间的复杂相互作用及其反馈调节称为串话效应（crosstalk）。本文就心力衰竭中心肌纤维化的发病机制做一综述，重点阐述 TGFβ 信号通路在心肌纤维化中的作用，以及 TGFβ 与microRNAs 的串话效应在心肌纤维化中的自身反馈调节，旨在为心肌纤维化及心力衰竭的防治提供更为特异和有效的作用靶点。

心脏重构；microRNA；转化生长因子 β；心肌纤维化

心力衰竭是各种危重心血管疾病的终末阶段，一旦起始，即使没有新的心肌损害，临床亦处于稳定阶段，仍可自身不断发展。心力衰竭已成为发达国家发病率和致死率最高的 疾 病， 心 衰确诊 患 者 5 年生 存 率仅为 50%[1]，这为全球带来了沉重的经济和社会负担。因此，各国的研究者一直着眼于寻求有效的心衰防治措施，对心衰的发病机制也有了更加深入的认识：从 20 世纪 40～60 年代的心肾学说到 70～80 年代的血流动力学学说，再到心循环学说以及90年代以来的心脏重构学说，从而为针对其发病机制给予更有效的防治措施提供了理论依据。近年来国内外研究者普遍认为心脏重构是心力衰竭发生发展的根本原因，心脏重构是由包括心肌细胞、心肌成纤维细胞和细胞外基质参与、通过一系列复杂的细胞和分子途径激活所诱导的动态过程。心脏重构的病理形态主要表现为心肌间质纤维化、心肌细胞肥大和心肌细胞凋亡[2]，其中心肌间质纤维化可以限制心肌细胞活动，增加心肌僵硬度，从而降低心室顺应性，影响心肌的收缩和舒张功能，是引起心力衰竭的重要原因。

1 心肌纤维化的物质基础

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）包括胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖及弹力纤维等物质，是生物活性信号分子的储存库。ECM 提供了细胞迁移、生长和分化的环境，其中纤维胶原蛋白是 ECM 主要结构蛋白，I 型和 III 型是构成心肌胶原网络的主要成分（分别为 85%和 10%），I 型胶原具有张力，决定心肌的硬度；III 型胶原的张力较I型胶原弱，但可形成良好的网状系统，决定心肌的弹性，胶原纤维的数量、分布及排列发生改变均可导致纤维化的发生，是心肌纤维化的物质基础。心脏成纤维细胞（CFBs）被认为是 ECM 的主要来源[3]，CFBs 在应激下可 转 分 化 为 心 肌 成 纤 维 细 胞 （MyoFBs）[4]， 具 有 更 大 的 活动性和收缩性，其合成 ECM 的能力也大大增加。MyoFBs是 Gabbiani 于 1971 年 首 先 鉴 定 并 命 名 的[5]， 在 正 常 心 肌中 不 存 在 ， 仅 在 心 脏 受 到 损 伤 之 后 出 现[6]， 许 多 平 滑 肌细 胞标 记可 以 在 MyoFBs 中 表 达而 不能 在 静 止 CFBs 中表达， 如 α- 平 滑 肌 肌 动 蛋 白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）， 平 滑 肌 肌 球 蛋 白 重 链 等[7]。 除 了 产 生 ECM 蛋白，CFBs还可 以 产生 ECM 调 节 蛋白 —— 基 质金 属 蛋白酶（MMPs）和它们的抑制剂基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs），基质金属蛋白酶可降解 ECM 成分，而基质金属蛋白酶组织抑制剂可抑制基质金属蛋白酶的活性，基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂之间的功能平衡对保持ECM 稳态是至关重要的[8]，在心肌纤维化的发生发展中发挥重要作用。

2 转化生长因子 β 信号通路及其在心肌纤维化中的作用

2.1 转化生长因子 β（TGFβ）及经典 TGFβ- Smad 信号通路

TGFβ 是多功能的细胞因子，广泛参与炎症、ECM沉积、细胞增殖、分化和生长等多种细胞功能的调节。活化的 TGFβ 通过细胞受体 系 统 介 导发挥作用，TGFβ受体是存在于细胞表面上的跨膜糖蛋白，目前公认的TGFβ 受 体 主 要 有 三 种 （TGFβRI、RII、RIII）[9]。 经 典的 TGFβ 信 号 通 路 通 过 Smads 蛋 白 介 导 发 挥 生 物 学 效应， Smads 介 导 的 TGFβ 信 号 通 路 大 致 是：TGFβ 成 员首先结合并激活细胞表面的 TGFβRII，接着募集并磷酸化 TGFβRI， 活 化 的 TGFβRI与 胞 浆 内 的 R-Smads 结合，使之磷酸化激活，磷酸化的 R-Smads 再与 Co-Smad（Smad4）结合形成复合物，并移位至细胞核，与序列特异的 DNA 结合元件（SBE）结合，并通过募集转录激活子或抑制子至转录复合物而相应的激活或抑制特定基因的转录[10]。 除 了 通 过 Smads 蛋 白 进 行 信 号 转 导 外，TGFβ 还可以通过其他非经典的信号通路激活，包括 ERK、JNK、p38/MAPK 和小分子 GTP 酶等通路。

2.2 TGFβ 在心肌纤维化中发挥重要作用

TGFβ 在心肌组织中可通过多种途径发挥强效的促纤维化作用：TGFβ 可通过调节心脏成纤维细胞的表型和功能，促进 MyoFBs 的转分化，增加 ECM 合成；通过抑制基质金属蛋白酶活性和诱导基质金属蛋白酶组织抑制剂合成发 挥 强 效 的 ECM 积 聚 作 用[11]；此 外，TGFβ 可 强 有 力 的诱导结缔组织生长因子的表达，与 TGFβ 协同作用可产生 持 久 性 纤 维 化[12]， 在 结 构 性 心 脏病 心 肌 组 织 中 表 达 明显 上 调。 在人 压力 负 荷 心 脏中，TGFβ1 明 显 上调[13]；在压力负荷大鼠模型中，TGFβ1 中和抗体可拮抗胶原蛋白mRNA 上调、心肌纤维化及舒张功能不全[14]。

3 MicroRNAs 与转化生长因子 β 在心肌纤维化中的串话效应

3.1 MicroRNAs 的发现、生成及其在心肌纤维化中的作用

MicroRNAs 是 一 类 长 度 为 21～25 个 核 苷 酸 的 非 编码内源性小单链 RNA 分子，在转录后水平通过降解靶mRNAs 或抑制靶蛋白翻译负性调控靶基因的表达。1993年 Lee 等[15]在 秀 丽 隐 杆 线 虫 中 发 现 第 一 个 microRNA（lin-4），能在转录后水平通过抑制核蛋白 lin-14 的表达调 节 线虫的幼 虫 发育进程。 在 哺乳动 物 中，microRNAs中 2～8 个核苷酸的“种子序列”与靶 mRNA 的 3’非翻译区的完全匹配是其负性调控作用的基础，利用“种子序列”已开发出多种生物信息学软件，可以在全基因组范围 内 搜 索 microRNAs 的 靶 基 因， 结 果 显 示 哺 乳 动 物 大约有 30% 的蛋白编码基因 受 microRNAs 调节。事实上，靶基 因 预 测 显 示一个 microRNA 可以抑制多个 蛋 白 编 码基 因， 而 一 个 基 因 编 码 蛋 白 可 以 受 多 个 microRNAs 调节。近年来成千上万的 microRNAs 在动植物中被鉴定出来， 其 中 多 数 在 进 化上 是 高 度 保 守 的[16]。 研 究 者在 研 究小鼠及人类成人器官的 microRNAs 表达谱时发现大约一半 microRNAs 的 表 达 具 有 组 织 特 异 性[17]，microRNAs的表达谱在许多疾病中均发生了戏剧性的改变，提示microRNAs 很可能在人类疾病 的发生发展中发挥重要的调节作用，这在近年来疾病状态下 microRNAs 表达谱改变的研究中得以印证。

MicroRNAs 的 生 成 始 于 microRNAs 基 因 转 录，转 录 形 成 初 始 microRNAs（pri-micorRNAs），primicroRNAs 通过两种 RNaseIII（即 Drosha 酶和 Dicer 酶 ）的 两 次 剪 切 产 生 成 熟 的 micorRNAs。Drosha 酶 在 细 胞核内将 pri-micorRNAs 剪切形 成包含有 65～80 个核苷 酸的 茎 环 样 结 构， 即 前 体 microRNAs（pre-microRNAs），pre-microRNAs 迅 速 被 Ras 相 关 核 蛋 白 GTP 酶（Ran-GTP）依赖的核质 /细胞质转运蛋白 Exportin5 转运至细胞浆中，然后在胞浆内 Dicer酶的作用下被进一步剪切成 大 约 22 个 核 苷 酸 的 双 链 microRNAs（microRNAs： microRNAs*）， 其 中 成 熟 microRNAs 选 择 性 地 整 合入 RNA 诱导的沉默复合物（RISC）中与靶 mRNAs 相互作用导致靶 mRNAs抑制或降解，另一条 RNA 链（即microRNAs*）随即被降解。 Drosha 和 Dicer 两种酶自身并不具有或只有较低的酶活性，只有在其他蛋白的协同作用下才能高效催化其 RNA 底物，例如，Drosha 需要在另外一种称为 DGCR8的蛋白配合下才能发挥其催化活 性，而 Drosha/DGCR8 复 合 体高效处理 microRNAs 尚需要 RNA 解螺旋酶 p68（DDX5）及 p72（DDX17）的加入。Dicer 酶也需要在因子 TRBP 和 PACT 的协同下识别与 剪 切 pre-microRNAs， 这两 个 因 子 能 增 强 Dicer 酶 对双 链 RNAs 的 亲 和 性 并 参 与 成 熟 microRNAs 链 选 择[18]；Argonaute2(Ago2)是 RISC 的 重 要 组 分， 具 有 很 强 的 类RNaseH 的 活 性， 可 以 通 过 切 割 掉 某 些 pre-microRNAs的 3’臂来帮助 Dicer加工。

MicroRNAs 参与心肌纤维化的调节，多种心血管疾病模型研究显示 microRNAs 表达谱发生明显改变，其中至少部分通过调节心肌纤维化进程促进或抑制疾病的进展。新近 文献详细论述了 miR-21、29、133、30 和 miR-590 等在 心 肌 纤 维 化 中 的 作用[19]， 阐明 了 microRNAs 的 调 节 机制在心肌纤维化进展中的重要作用。

3.2 MicroRNAs 与 TGFβ 信号通路的 串 话效应在心肌纤维化中的调节

MicroRNAs 以 TGFβ 通路 及其下游基因编码蛋白为靶点调节心肌纤维化。 前面我们已经介绍了 TGFβ 及其 经 典 TGFβ- Smads 信 号 通 路 在 心肌 纤 维 化 中 的 作用，而近年来研究显示 TGFβ 通路中的大部分成员是microRNAs 的 靶 标。 运 用 生 物 信 息 学 microRNAs- 靶mRNA 预测可以获得数个可能的相互作用，但这些计算机预测往往需要实验验证，由于缺乏高通量测序的方法进 行 microRNA- 靶 mRNA 相 互 作 用 的 监 测， 至 今 仅 有少 数 microRNAs 与 TGFβ 通 路 成 员 的 相 互 作 用 得 以 验证 ，已有综述对此进 行 了 总结[20]。 在 心 脏纤维化过程中，miR-133 通过调节狗心房成纤维细胞中靶蛋白 TGFβ1的 水 平， 有 效 抑 制 心肌 纤 维 化 的 发 展[21]。 Liang 等[22]研究 证实 TGFβRIII 作为 TGFβ 信 号通 路 的负性 调 控子，可抑制其心肌纤维化作用，而 miR-21 可直接负性调节TGFβRIII 的表达，对心肌纤维化起到促进作用。此外，microRNAs 还可以调节 TGFβ 通路靶基因编码蛋白，结缔组织生长因子（CTGF）作为 TGFβ 信号通路的靶分子，是一种强效致纤维化因子，作为 miR-1 和 miR-133 的靶蛋 白 被 直接 负 性 调 控[23]。 可见 ， microRNAs 可 在 多 水 平通过与 TGFβ 通路蛋白相互作用调节心肌纤维化的发生发展过程。

TGFβ- Smads 通 路 可 在 转 录 和 转 录 后 水 平 调 节microRNAs 的合成和表达。首先，microRNAs 自身的表达水平可通过 Smads 蛋白在转录和转录后水平调节。Smads蛋白对 microRNAs 在转录水平的调节主要是通过 TGFβ-Smads 经 典 信 号 通 路，R-Smad/Co-Smad 复 合 体 通 过 与核 内 Smads 结 合 元 件 (SBE) 相 互 作 用 正 性 或 负 性 调 节microRNAs 基 因 的 转 录， 转 录 生 成 的 pri-microRNAs 经历正常的 microRNA 加工处理过程。其次，Smads 蛋白对microRNAs 在转 录 后水 平的 调 节则 是通 过 对 microRNAs加工成熟过程的调节 完 成的。研究证实 R-Smads 可以通过 与 p68/p72 相互作用以增强 Drosha 调 节 的特定 primicroRNAs 的 剪 切 活 性， 例 如 miR-21[24]。 为 了 研 究 可被 Smads 调 节 的 pri-microRNAs 的 结 构 特 性， 进 行 了microRNAs 芯片表达谱的研究，结果表明大约 5% 被检测microRNAs 可以同时被 TGFβ 和骨形态发生蛋白（BMP）诱导，而这些 microRNAs 的成熟形式的 3’序列末端均包含一个 SBE 样的序列（R-SBE）[25]，R-SBE 是 Smads 蛋白与 pri-microRNAs 结合所必要的。此外，Smads 蛋白还可能通过介导表观遗传学的调节方式来实现 microRNAs 的表达改变。

4 结语

心肌纤维化是心脏重构的重要组成部分，是众多心血管疾病的病理表现及致病因素，贯穿于心力衰竭发生发展的整个过程。心肌纤维化的物质基础是 ECM 的过度沉积及错误排列，TGFβ 是强效致纤维化因子之一，其相关信号通路可通过促进 ECM 沉积、降解基质金属蛋白酶以及抑制基质金属蛋白酶组织抑制剂等途径促进心肌纤维化的发生。此外，TGFβ- Smads 通路蛋白还可以通过在转录和转录后水平调节特定 microRNAs 的合成及成熟对心肌纤维化进行转录后水平的调节，而此通路蛋白同样受microRNAs 在多水平的调节，这一发现使我们对心肌纤维化的调节机制有了更深入的认识，TGFβ- Smads 信号通路与 microRNAs 之间的串话效应在心肌纤维中形成了一个自身反馈调节系统，使各种不同病因下的心肌纤维化受到精细的调节。以 TGFβ 及 microRNAs 之间的反馈环路为靶点治疗心肌纤维化，有望为心肌纤维化和心力衰竭的治疗掀开新的一页。

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2013-05-28)

（编辑：常文静）

130033 吉林省长春市，吉林大学中日联谊医院 心血管内科

杨四宝 博士研究生 主要从事心血管疾病及相关基础研究 Email：yangsb911@163.com 通讯作者：杨萍 Email：pyang@jlu.edu.cn

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1000-3614（2013）07-0552-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.07.21