繁殖生物技术在水牛生产中的应用研究

(广西玉林市水产畜牧兽医局，广西玉林 537000)

水牛是我国南方地区饲养的本地品种，适应性和抗病力较强、耐高温高湿、耐粗饲、易饲养、使用年限长，且水牛奶营养丰富。我国水牛品种资源丰富，存栏量居全球第三位，但饲养的水牛均为沼泽型，体型较小且生长缓慢，产奶性能较低，年均产奶量仅1000 kg左右。20世纪50年代和70年代，我国先后从印度和巴基斯坦引进摩拉水牛和尼里-拉菲水牛各50头，对本地水牛进行杂交改良。引入的河流型水牛，体型较大，生长较快，产奶量较高，与本地水牛杂交后代奶水牛年产奶量可达1200～2000 kg，可明显提高本地水牛的产奶性能。

发展奶水牛养殖，投资少，风险小，效益高。尤其是近20年来，我国不少地区加大了水牛资源开发的经费投入，明确提出把发展水牛奶业作为发展农村经济新的增长点，提出开发利用水牛是全国农业和农村经济结构调整，增加农民收入，解决农村富裕劳动力就业的重要途径。为此，不少地区专门成立了水牛研究所和水牛种公牛站，用于水牛的科学研究和种牛供应。特别是开展水牛繁殖生物技术的应用研究，第一阶段是对水牛超数排卵和活体采卵、胚胎性别鉴定和胚胎移植等一整套胚胎生物技术进行研究和开发，主要目标是提高水牛品质和新品种的形成。第二阶段是采用转基因和体细胞克隆等技术，以培育水牛新品种和提高水牛养殖效益。

1 超数排卵和同期发情

一般母牛每次发情只排一枚卵。人们通过使用外源激素，能使母牛一次排多枚卵以生产多个胚胎，通过胚胎移植加快优良母牛的基因扩散。水牛卵巢上原始卵泡数比奶牛低30%，卵泡闭锁率较奶牛高，且水牛对超排药物反应力低，个体反应差异大。因此，胚胎回收率远低于奶牛。近年来，水牛的胚胎回收率虽有很大提高，可用胚胎可高达2.5～3.0枚，但大多数仍在1.0～2.0枚左右。常用于水牛超排的促性腺激素有PMSG(孕马血清促性腺激素)和FSH(促卵泡素)，FSH的超排效果优于PMSG，每次超排获得有效胚胎的数量是2.09比0.56。

同期发情技术可便于掌握适时输精，缩短发情配种时间，有利于提高人工授精配种受胎率和胚胎移植受胎率。近年来，国内对水牛同期发情技术的应用做了初步研究，发展了多种同期发情方法应用于诱导发情和排卵，如孕酮法、两次PGF2α法，GnRH 结合前列腺素法、孕酮和ECG 方法等。研究表明通常有优势卵泡和黄体存在时处理成功率较高；在繁殖季节同期发情的效果较好；在乏情季节，结合使用孕酮可提高受胎率。

由于水牛对激素类药物的反应力较低，个体差异较大，而且多出现安静发情，因此超数排卵和同期发情的效率仍然较低。需要制订中长期的研究计划，探讨水牛卵泡发生和繁殖内分泌规律，找出有效的发情鉴定方法。

2 胚胎体外生产

胚胎体外生产(IVP)包括卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外胚胎培养(IVC)。通过IVP可大量生产良种胚胎，是解决水牛品种改良过程中胚胎来源困难的一条有效途径。胚胎体外生产的卵母细胞来源主要分为屠宰场卵巢和活体采卵(OPU)。屠宰场卵巢容易获得，但由于系谱不明确，且绝大部分为沼泽型水牛卵巢，因此对水牛品种改良的意义不大。OPU通过B型超声波引导，经子宫壁采集卵母细胞，可重复从遗传价值较高的水牛采集卵母细胞，与体外受精技术相结合可生产大量系谱明确的胚胎，从而充分利用优良母牛的遗传潜力。OPU与体外胚胎生产技术相结合，生产的可移植胚胎为超数排卵的2～3倍，每头供体每月可生产更多的可移植胚胎(2.0±0.6枚)，且可克服母牛生殖道疾病对胚胎质量的影响。

体外胚胎生产虽已取得一定成绩，但水牛胚胎体外生产所需条件较高，需要专门的仪器设备进行操作，实质上仍处于研究阶段，尚未真正应用于生产。今后应降低胚胎体外生产成本，提高体外生产效率。目前已由专业单位进行良种胚胎体外生产，而后将胚胎冷冻保存，提供给基层水牛养殖户进行移植生产。

3 胚胎移植

胚胎移植是水牛超数排卵、体外受精、体细胞核移植的最终环节，对良种水牛的扩繁具有重要意义。胚胎移植首先要解决供体母牛与受体母牛发情同期化问题，常用的方法与供体母牛情期同期化处理基本一样，受体母牛注射两次PG或其衍生物，使注射间隔时间11 d。胚胎移植的操作关键是将胚胎准确地输入到卵巢有黄体的子宫角中。由于水牛黄体突出表面不明显，难以触诊，给胚胎移植准确到位带来了一定困难。母牛子宫颈在发情后不久就处于基本闭锁状态，使输胚管插入困难并容易造成子宫损伤，影响胚移受胎率。为了提高受胎率，一般以选用已产2胎以上的母牛作为受体母牛较好。

由于受体牛的质量不能保障，所以水牛胚胎移植效率较低，一般水牛鲜胚移植受胎率只有6%～13%，个别试验受胎率达到33.7%～66.7%，胚移受孕水牛3个月内流产比例较高，流产率有时可达40%～50%。因此应加强和建立规范的受体母牛饲养管理，开展胎儿互相作用和胚胎发育免疫学研究，以提高水牛胚胎移植效率。

4 胚胎冷冻

胚胎冷冻技术可突破时间和空间限制，解决胚胎生产与移植在时间和地域方面的矛盾，实现水牛胚胎本地生产异地移植，还可长时间保存优良种水牛的遗传资源，便于胚胎运输，促进水牛繁殖生物技术的推广应用。

但因种种原因，水牛胚胎冷冻技术尚未得到广泛应用。今后应深入广泛开展水牛胚胎冷冻保存技术研究，从冷冻保护剂、冷冻方法、胚胎发育阶段等方面进行深入研究，以切实提高水牛胚胎的冷冻存活率，加速胚胎冷冻技术的应用。

5 性别控制

目前，实现家畜性别的人为控制主要有两个途径：一是X 精子和Y 精子的分离；二是早期胚胎的性别鉴定。研究表明，将牛的精子分离后进行人工授精，产下母水牛的成功率为94%，公水牛的成功率为91%。使用流式细胞分类仪分离X、Y 精子，准确率达90%以上，分离的精子用于体外受精，生产的胚胎移植后产下经XY精子性别控制的雌雄水牛双犊。通过胚胎分割结合PCR技术进行性别鉴定，切割胚胎移植后得到了性别控制水牛犊；其胚胎性别鉴定的准确率可达100%，胚胎分割后的存活率可达80%以上。

使用性别控制技术进行繁育奶水牛的效率将比无性别控制的提高1倍左右，对加速繁殖良种水牛，推动水牛奶业发展具有重大现实意义。

6 体细胞核移植及转基因研究

体细胞核移植在短期内可大量复制具优良基因的动物个体，并为转基因技术研究提供基础。水牛的体细胞核移植研究开始较晚，操作复杂，影响因素较多。自2005年首例水牛体细胞克隆牛犊诞生，到目前为止，仅报道3例成活的克隆水牛。

转基因技术是基因工程和胚胎工程结合的一门生物技术。转基因动物生产是使用转基因工程技术将选定的目的基因导入动物染色体组，并整合表达和遗传的过程。通过转基因克隆方法对水牛进行定向遗传改良和研发高效乳腺生物反应器，可解决水牛奶业开发面临的水牛繁殖率低和产奶量低等问题，提高水牛的经济价值。

国家转基因专项重大课题“高繁殖力和高产奶量转基因水牛新品种培育”立项后，已先后培育出世界首例单精子显微授精的转基因水牛、世界首例慢病毒介导的转基因水牛、世界首例转基因克隆水牛。该课题将采用先进转基因技术改良水牛的遗传性状，提高水牛的繁殖力和产奶量，培育高繁殖力和高产奶量的水牛新品系，提高水牛养殖效益。

水牛业是正在崛起的新兴产业，水牛业的发展直接和间接影响着“三农”问题的解决，是不可忽略的问题。水牛繁殖受气候和季节的影响较大，发情征兆不明显给发情鉴定带来一定困难，发情间隔时间长、受胎率低，这些因素制约着水牛的繁殖力。尽管如此，通过科研人员对水牛繁殖内分泌学的研究，以及对水牛人工授精、胚胎移植、体外受精、胚胎冷冻等生物技术的研究，使水牛繁殖性能的提高呈现了希望。随着超数排卵、核移植、转基因等新兴生物技术在水牛生产中的研究，相信将来水牛的遗传潜力和水牛奶业将会得到更好的发展。