DDRT－PCR技术在中药研究中的应用

丁常宏，都晓伟，徐莹

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

真核生物一般约有10万个基因，而在单个细胞中，仅有约15%的基因可以表达。基因的选择表达，决定着整个生命过程中的发育、分化、应激反应、内环境稳定、细胞周期调控等。基因的这种差异表达不仅受生物体内在机制的调控，也受外界环境因素，如光照、温度、逆境、药物作用等的影响。如何有效地分离并克隆在不同处理条件下、不同发育阶段或不同细胞群体间差异表达的基因，是分子生物学研究的一大热点。目前，分离克隆差异显示基因的方法主要有扣除杂交(subtractive hybridiza－tion)、mRNA差别显示(mRNA differential display reverse transcription，DDRT－PCR)、基因表达系列分析(serial analysisof gene expression，SAGE)、代表性差异分析(representational difference analysis of cDNA，cDNARDA)、抑制性扣除杂交(sup－pression subtractive hybridization)、RFLP与区域定向差异技术偶联的DDRT－PCR(RFLP－Coupled domaindirected display，RC4D)、cDNA － AFLP、基因芯片等。其中由Liang等发明的DDRT－PCR因为具有简便、快速、高效、所需RNA量少等优点而被广泛用于真核生物基因差异表达的研究和差异表达基因的分离克隆［1］。这里综述了该技术的原理，并简要介绍了其在中药学研究中的应用。

1 DDRT－PCR技术基本原理

mRNA差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT－PCR)是一种比较不同细胞系、不同组织间，或同一细胞系、同一组织不同条件下基因表达差异的技术方法。该技术可分为三个基本步骤。第一步RNA的提取及反转录:分别提取两种或多种材料中的总RNA或mRNA，反转录成cDNA。第二步PCR扩增:利用cDNA3'端锚定引物和5'端随机引物组成引物对，在较低退火温度下(32～42℃)扩增生成cDNA。第三步分离比较扩增产物:利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，对PCR产物进行分离，由于扩增的cDNA片段被放射性同位素或荧光素标记，通过自显影或显色技术，即可获得差异表达基因扩增的条带，但大多数情况下，以方便、节约为目的，利用银染技术显示差异条带，在相邻泳道上比较基因表达的差异［2］。

与传统的方法相比，DDRT－PCR技术能够快速地显示mRNA的组成，可同时对比多个样本mRNA的差异，扩增的cDNA可以用来测序、亚克隆及用作探针筛选文库。并且由于PCR扩增技术的运用，可同时获得高丰度和低丰度表达的基因。当然DDRT－PCR技术也存在假阳性多、特异性cDNA片段短、扩增倾向高丰度mRNA等不足。目前许多学者对DDRT－PCR技术进行了改进:如从引物的长度、组合的数目、碱基的组成方面进行改进;通过优化PCR循环参数来提高DDRT－PCR技术的重复性、明显降低假阳性率;通过扣除杂交、巢式引物重扩增cDNA片段等方面来降低假阳性;在从聚丙烯酰胺凝胶上切取差异条带时，选取相互对照组的各组间信号强度对比明显的条带，当在切下的一条带中可能含有几条cDNA片断时可用单链构象多态性(SSCP)方法区分开来;用反向Northern点杂交检测阳性克隆可大大减少工作量;也有用Real Time－PCR的方式来鉴定差异片段的方法，去除假阳性的困扰，无论从准确性还是减少工作量方面都有了较多的改进。

2 DDRT－PCR在中药研究中的应用

DDRT－PCR技术已成为分析基因差异表达、分离和克隆差异表达基因的有力工具。这项技术近年十年来已开始在植物、动物、微生物［3］研究中应用。目前在生物的基因表达［4］、基因的鉴定与克隆［5－6］、植物抗性［7］、环境胁迫［8－9］、病理［10］等方面已有成功报道。但在中药研究中应用的例子还不多，但已显示出极强的可塑性和应用性。

2.1 中药作用机制的研究

DDRT－PCR技术可以比较同一种组织或细胞在使用某种中药或中药活性成分处理后所引发的基因差异表达，筛选差异表达基因，以此来研究该中药或其活性成分对细胞行为的影响。DDRT－PCR可以从基因表达的水平入手，研究特定细胞(靶细胞)在mRNA水平上药物的干预情况，所以可以更全面揭示药物的作用机制，更好地阐明中药的多环节、多靶点的作用方式。

苦参碱可用于人白血病的治疗，何於娟等［11］应用改良的DDRT－PCR技术研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制，得出苦参碱能诱导K562细胞基因表达谱发生变化，而且此过程是一个多基因参与的过程。郝岗平等［12］用DDRT－PCR方法研究发现丹参注射液处理动脉粥样硬化大鼠，会使其胸主动脉细胞发生一些基因表达水平发生变化，减弱血管内皮细胞发生的病理变化，从而阻碍动脉粥样硬化斑块的形成。王泽平等［13］用泰山赤灵芝多糖注射液处理动脉粥样硬化大鼠，观察其血脂的变化，并利用DDRT－PCR技术筛选大鼠胸主动脉细胞用药前后差异表达的基因，了解到泰山赤灵芝多糖治疗动脉粥样硬化、降低血脂的分子机制。GY Shi等［14］利用DDRT－PCR技术研究了长春瑞滨和多烯紫杉醇作用于人肺癌细胞株时引发的基因表达差异，以探索两种抗肿瘤药物的治病机理。

2.2 中药复方作用机制的研究

中药复方成分复杂，且各种成分含量极微，它对机体的调控作用是多靶点、多环节的，至今很多中药复方的作用机制仍不明确。传统的方法往往从全方或拆方的角度得到一些片面或表面的结论，不能深入发掘中药复方的作用机制，也很难顾及中药复方的复杂性和整体性。血清药物化学、分子生物学等可以对中药复方进行整体把握的现代手段逐渐被应用并取得了阶段性的进展。其中DDRT－PCR技术就可以了解复方对整个细胞基因表达情况的影响，通过各自不同的表达谱，比较研究不同配伍组方对应的基因表达靶点，并可根据表达水平与复方的君、臣、佐、使理论及用药剂量相关性，阐明药物作用的物质基础及其内在配伍规律。

近年来的研究工作主要表现在通过比较复方对细胞基因表达谱的影响，鉴别差异表达的基因，从而寻找复方作用的靶基因并推测中药复方作用的分子机制及内在规律。柴立民等［15］利用DDRT－PCR技术分析在益髓生血颗粒治疗前后，β－珠蛋白生成障碍性贫血患儿骨髓有核细胞的基因表达差异。发现治疗3个月后患儿的铁蛋白基因表达明显降低，这有效缓解了患儿体内铁的蓄积，推测可能是益髓生血颗粒治疗β－珠蛋白生成障碍性贫血病的分子机制之一。

马宇漠等［16］利用DDRT－PCR技术研究用健骨冲剂对去势大鼠处理后，其骨组织中基因的差异表达。共筛选出10条有差异表达的基因片段，其中2条为透明质酸调节的运动受体(RHAMM)和Na+－K+－ATP转运酶β3亚单位(ATPlb3)的mRNA片段。而且这两个片段在健骨冲剂作用后表达分别下降和上调。张冲等［17］利用DDRT－PCR技术探索补肾益脑片对快速衰老小鼠的生理及其脑组织基因表达的影响，得到14个差异表达条带，发现其中的3个条带的序列分别与脂肪酸结合蛋白－7、还原型辅酶Q－细胞色素c还原酶复合体7.2kD亚单位及核糖体大亚基的第21亚单位的mRNA序列同源。同源性分别达到97%、100%、99%。从而得出补肾益脑片抗衰老功效的发挥可以通过调节小鼠脑组织基因表达水平来实现。杨婷等［18］应用DDRT－PCR技术研究补肾益脑片提取物作用后，SAM P10/Ta小鼠原代培养的神经细胞基因表达的变化情况。共发现了10个差异片段，通过分析鉴定认为补肾益脑片抗衰老作用的发挥可能通过影响与衰老相关的基因表达来实现。

2.3 中药植物生物学的研究

药用植物是中药来源和质量的基础保障，对于药用植物的生物学研究有助于对其发育生物学的各项特征和药理、药效方面特征的把握，有利于提高中药材的质量和产量。近十几年来，将DDRT－PCR技术应用于药用植物生物学的研究也收获了较多成果。

M Kakinuma等［19］利用 DDRT－PCR 技术研究了热和盐胁迫下孔石莼不育突变体生理生化的改变。J Xu等［20］利用DDRT－PCR技术研究鉴定了龙葵幼苗镉应答的基因。盛玮等［21］利用DDRT－PCR技术，分离并克隆半夏试管小块茎发育过程中表达的相关基因片段，得到15个特异表达的cDNA片段。通过同源性比照发现其中6个在GeneBank中没有与之匹配的同源序列，可能为新的cDNA片断。3个片段分别与真核生物启动子、MADS－box蛋白及乙烯信号转导因子具有较高的同源性，并在半夏块茎形成不同天数高度特异表达。李标等［22］利用DDRT－PCR技术研究瘤菌属菌根真菌AR－18促进药用植物福建金线莲生长发育的分子作用机制，运用重扩增、反式Northern点杂交等筛选，发现5条上调表达基因，其中包括编码尿磷酸核苷转移酶基因(UPRTs;EC2.4.2.9)、编码氨基酸跨膜转运子的基因、编码突变酶K(matK)的基因等，并讨论了差异表达基因的功能。

3 展望

DDRT－PCR技术在1992年建立以来，一直受到其他技术如基因芯片、抑制消减杂交等的挑战，而且其自身也存在一定的缺陷。但随着其实验技术的不断改进和完善，高效试剂盒的出现，使这项技术在生物新基因的分离与克隆、基因差异表达等方面的使用频率越来越高，尤其是对于仅有少量样品和要对多种不同处理进行比较的情况下，DDRT－PCR仍然是目前筛选差异表达基因最有效的方法。在中药的研究中，DDRT－PCR技术也可以在以下方面发挥重要作用。

3.1 中药材的作用机理分析 现在关于这方面已有一些相关的研究，并取得了一定的进展，但仍有相当大的发展空间和较多的研究方向。如果能利用mRNA的差异表达分析中药作用后细胞或组织在基因水平上的改变与调节，清楚了解中药最本质的作用机理，相信定能帮助中药材更好的走向世界。

3.2 增强药用植物的抗性 中药材讲究绿色天然，对于其栽培过程中施加的农药和肥料都有一定的要求，正因如此中药材的病虫害防治问题常令人困扰。如今DDRT－PCR技术在植物抗性基因的鉴定与克隆方面已取得了很多研究成果［7］，如果有比Bt、Ht等基因更安全有效的抗性基因可以转入中药植物中，必将为中药材的安全性做出更大的贡献。

3.3 道地药材形成机理的研究 地道药材在分子方面的研究往往只局限在应用AFLP、RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP等分子标记技术上。笔者认为，在基因差异的层次之上，更有必要对其表达水平进行研究，因为基因通常是表达之后才彰显其作用的。如果分析清楚相同时期道地药材和非道地药材在表达水平上的差异，可能对道地药材形成机理的研究会有很大的帮助。

3.4 药用植物与内生真菌相互作用机理的研究

1993年美国蒙大拿州立大学Strobel小组首次从短叶红豆杉(Taxus brevifolian)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌，至今，人们已先后从近百种药用植物中分离得到了多种内生菌，并利用内生菌发酵促进药用植物或药材产生了某些重要的天然活性成分。但对于药用植物和其内生真菌相互作用的机理尚未明确的阐述，DDRT－PCR可以帮助我们从基因表达的水平上做一探求。

除了以上几个方面DDRT－PCR技术还在药理研究、复方配伍等方面为中药的研究开辟了新的思路和途径。可以相信，随着人们认识的深入和DDRT－PCR技术的完善和普及，DDRT－PCR将在中药的研究中发挥更为重要的作用。

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