烟草萜烯类化合物种类及其分析方法研究进展

2013-01-22曹晓玉杨佳玫杨虹琦王玉平尹丽莉

作物研究 2013年3期

曹晓玉，杨佳玫，杨虹琦* ，王玉平，尹丽莉

(1湖南农业大学烟草科学与健康重点实验室，长沙410128;2贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵阳550009)

早在1887年，Wallach根据萜类化合物的结构特点提出了异戊二烯规律，并给出了不同萜类化合物的定义。萜类化合物是异戊二烯(C10H16)的聚合体及其含氧的饱和程度不等的一类衍生物的统称。从结构上划分成若干个异戊二烯单位，而称为异戊二烯规律。其实生物体内萜类并非由异戊二烯相互聚合形成的，植物体内萜类形成的前体是乙烯生成的甲戊二羟酸，称为生源的异戊二烯规则［1，2］。按其在植物体内的生理功能，植物中萜类化合物可分为初生代谢物和次生代谢物两大类。萜类化合物作为初生代谢物的数量少，却极为重要，包括甾体、胡萝卜素、植物激素、多聚萜醇、醌类等。此类化合物中的一部分是细胞膜组成成分和膜上电子传递的载体，还有一部分是对植物生长发育和生理功能起作用的成分。萜类化合物的主要功能包括:膜上电子传递的载体，如醌类;参与光合作用，如胡萝卜素类和叶绿素的侧链;植物激素，如赤霉素、脱落酸。也有人把萜类化合物看作是植物的植保素，虽然不是植物生长发育所必需的物质，但在调节植物与环境之间的关系上发挥着重要的生态作用，是植物中不可或缺的组成成分。

萜类化合物根据组成的异戊二烯单位的数量不同可分为半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、三倍半萜和四萜等。含有一个异戊二烯单位的萜类称为半萜，含有两个异戊二烯单位的萜类称为单萜，据此类推，划分萜类化合物。这些萜类都有开链和成环之分。根据分子中的碳环数目，也可将萜烯类化合物分为链萜(无环萜)、单环萜、双环萜、三环萜等。而萜类大多数是含氧衍生物，据此又可分为萜醇、萜醛、萜酮、萜羧酸和萜酯等［1］。

分子中含有双键的萜类化合物又可称为萜烯类化合物。萜烯类化合物迄今为止已发现了近3万种。萜类化合物是植物和动物体内大量存在的天然有机化合物，其中有半数以上是在植物中发现。如从植物中提取的香精油、薄荷油、松节油等，植物及动物体中的某些色素，胡萝卜素、虾红素等等。

1 植物萜类化合物的种类

萜类化合物的种类繁多，数量庞大，在植物中的分布极为广泛。藻类、菌类、苔藓类、地衣类、蕨类、裸子植物及被子植物中均存在萜烯类化合物，其中种子植物特别是被子植物含量最为丰富。在种子植物中分布广泛，普遍存在于松科、柏科、楝科、唇形科、伞形科、菊科、卫矛科、樟科、蓼科等20多个科中。种类繁多，大致统计有1万种以上，是植物次生代谢产物中最多的一类化合物。萜类化合物经常和树胶、树脂等并生，富含生物碱的植物通常不含萜类化合物或含量较少，而水生植物中暂未发现单萜或倍半萜类化合物。其中，单萜在唇形科、伞形科、樟科及松科等植物的腺体、油室及树脂道内广泛存在。倍半萜集中分布在木兰科、芸香科、菊科等植物中。二萜于五加科、马兜铃科、菊科、橄榄科、杜鹃科、大戟科、豆科、唇形科及茜草科等植物中主要分布，是形成树脂的主要物质。二倍半萜数量较少，于羊齿植物、菌类、地衣类中主要分布。三萜是构成植物皂苷、树脂等的重要部分。四萜主要为一些脂溶性色素，广泛分布于植物中。

植物中“低萜类化合物”也被称为“挥发油”，多具挥发性，常以挥发油的形式存在于高等植物中。芬兰研究者Von等从杜香属植物(L.palustre)中分离鉴定出了几种脂肪族单萜的结构［3，4］;Lawrence等从杜香属植物挥发油中第一次分离提取得到萜类化合物反－3－己烯醇等［5］;Milkhaliova等从杜香属植物中分离出香叶烯、喇叭茶醇、倍半萜类化合物青蒿素(C15H22O)［6］;Yu 等［7］将栀子果实以 60% 的乙醇提取，然后浸膏，经过D101大孔吸附树脂柱分离，接着用硅胶柱分离，再采用ODS柱、凝胶柱和凝胶树脂系列Toyopearl－40 HW凝胶柱产品反复分离，最后利用制备型高效液相分离，得到单萜类化合物;Chen等采用类似的方法分离得到裂环环烯醚萜苷类成分化合物［8～10］。

环烯醚萜是一类双环单萜，在现今研究资料中研究比较多。环烯醚萜类化合物在双子叶植物中广泛分布，为许多植物药类的有效成分，如地黄、玄参、栀子、龙胆、车前草、山茱萸、马钱子、忍冬、肉苁蓉、鸡屎藤和胡黄连中均含该类化合物［11］。该类化合物具有抵抗糖尿病、保肝、利胆和促消化等作用。

二萜类化合物中链状二萜多以植物醇的形式存在，多分布于叶绿素中。在植物雷公藤、紫杉、甜菊叶和黄芩属植物中都有环状二萜成分的存在。据文献报道，目前在黄芩属植物中分离得到的二萜化合物大部分为新克罗烷双环二萜。

三萜类化合物在单子叶和双子叶植物中均有存在，尤以豆科、石竹科、五加科、桔梗科、远志科、玄参科等科的植物中分布最为普遍，含量也较高。从小花五味子(S.micrantha)藤茎中分离得到的高度氧化重排的降三萜化合物也显示出较强的抗HIV－l活性，EC50为 7.71 μg/mL(SI＞ 29.54)［12］。近年来研究发现，三萜类化合物具有抗HIV病毒和抗癌等作用。

四萜类衍生物中一类重要物质就是多烯色素(polyene pigments)，又称类胡萝卜素(carotenoid)，其在植物中分布很广，如植物叶片中的叶黄素(xanthophyll)、辣椒果实中的辣椒红素(capsorubin)。而且类胡萝卜素在烟草中也有集中分布。由于四萜类化合物分子中有很长的共轭结构，因此大都有漂亮的颜色，但对光、热、氧、酸不稳定，所以容易发生结构改变。四萜类化合物在植物体内具重要生理功能，部分是对植物生长发育和生理功能起重要作用的成分，有些在调节植物与环境之间的关系上发挥重要的生态功能。

2 烟草中的萜烯类化合物

烟草中富含萜烯类化合物，且种类繁多。如类胡萝卜素、叶绿素、赤霉素、脱落酸、甾醇等三萜、四萜化合物，它们一般被划为初生代谢产物，是烟草生长发育所不可缺少的;而单萜、倍半萜、双萜则属于次生代谢产物，是烟草叶面挥发物和腺体分泌物的主要组成部分，与烟叶的抗性和香气品质密切相关［13］。因此，调控类萜代谢途径，对于提高烟草自身对病害的免疫能力，以及改善烟叶香气品质至关重要。

萜烯类化合物按烟草香味前体物划分为3类:类胡萝卜素、西柏烷类和赖百当类。赖百当类化合物是香料烟叶中独有的香气成分。Loughrin等通过烟叶组织和花组织的顶空分析发现，有多达40种挥发性萜烯、芳香和脂肪族化合物均来自于烟花中［14，15］。

类胡萝卜素是烟草中最重要的萜烯类化合物之一，也是烟叶中重要的香气前体物。类胡萝卜素的降解产物在所有的烟叶中都发现，包括紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等，种类已近100种。其中，紫罗兰酮和大马酮可增加烟草的花香香味，而异佛尔酮目前是国内外广泛使用的烟用香料的原料。

类胡萝卜素在成熟过程中的变化总趋势是逐步减少，而在调制过程中则降解加速。1974年，Whitefield等通过观察，发现所有色素均随成熟过程的推进下降;1979年，Gopalam等通过对印度烤烟成熟期的分析，发现胡萝卜素含量逐步下降。在烟叶醇化过程中，类胡萝卜素不仅持续降解使中性香味物质总量增加，而且降解产物能发生转化，生成对于香味方面更有用的化合物。因此，烟叶经过调制、醇化后，绝大部分类胡萝卜素都分解消失。罗勃茨等研究指出，烟叶香味与类胡萝卜素的存在成反比;如果类胡萝卜素在调制、醇化过程中不分解，则烟叶的香味不足［15］。色素类物质氧化降解是由于双键断裂，而双键断裂的部位不同，产生的碳原子数的化合物不同，从而进一步形成许多重要的香气物质。不同类型烟叶和不同的调制方法，其降解产物也相应不同。

西柏烷类(黑松烷类)化合物及其降解产物也是构成烟草香味的重要组分。在酶解或加热等条件下，西柏三烯－4，6－二醇降解，在键的断裂过程中，得到茄尼酮。茄尼酮是烟草中的重要香气成分，它进一步反应的产物大多也具香味。在酸的催化下，茄尼酮端基烯键和水作用形成醇。经过过氧酸的作用，形成环氧化合物，但该中间产物不稳定，其酮基与环氧基相互作用形成氧杂的双环化合物。该化合物具有的特别香味，对改变烟草香味物质起到积极的作用。而茄尼酮经一系列环化氧化反应同时可形成烟草中有名的香味物质α－异丙基丁酸内酯。烟叶调制前后，西柏烷类物质含量有明显差异。调制和醇化后，西柏烷类化合物含量显著降低，其降解转化成为其他产物，如西柏三烯的a+c，a+e，b+e，c+e位断裂分别得到 C18、C15、C14、C13 的降西柏烷类化合物，其中 C13 即茄尼酮［16，17］。

类黑松烷巨环双萜烯及其降解产物对烟草的香味有重要作用，有人认为其前身是西柏烯。1975年，斯伯林格等对黑松－2，7，11－三烯－4，6－二醇作了同样研究。研究表明类黑松烷巨环双萜烯均具旋光性，且黑松－2，7，11－三烯－4，6－二醇是新鲜烟叶蜡质的主要成分，它在烟叶调制、醇化过程中有四种降解途径:羟基氧化为羟酮或二酮类化合物;羟基氧化脱氢成为四烯醇;羟基氧化脱氢成为四烯醛;C18二烯氧化还原成为羟基酮酸。羟基酮酸和四烯醛类都是茄酮的前体。烤烟、白肋烟、香料烟中都有类黑松烷巨环双萜烯及其降解产物的存在，它们对烟草的香味有重要作用。

3 萜烯类化合物的分析方法

3.1 萜烯类化合物分离提取

现今植物萜类化合物的提取主要包括溶剂提取法、碱提取酸沉淀法和吸附法三大类［1］。分离纯化主要包括凝胶柱层析、硅胶柱层析、大孔吸附树脂层析、反相柱层析、超临界流体提取、制备型高效液相分离等技术。

溶剂提取法是国内外应用最广泛的方法，可分为苷类化合物和非苷类化合物的提取。前者用甲醇或乙醇作溶剂提取，减压浓缩转溶于水，将水中不溶性杂质滤除，然后用乙醚或石油醚萃取，将残留的树脂类等脂溶性杂质除去，再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇后即得粗总苷。后者与前者的溶剂一致，减压回收醇液到无醇味，然后残留液再用乙酸乙酯萃取，接着回收溶剂得总萜类提取物，或用不同极性的有机溶剂按极性递增的方法依次分别萃取，得不同极性的萜类提取物，最后进行分离。

溶剂提取时的有机溶剂包括二氯甲烷、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、丙酮和石油醚［18～21，37］等。溶剂提取时，可采用超声法、渗漉法、室温浸泡或热回流提取法，也可以采用超临界CO2萃取法和索氏提取方法以及水提醇沉法或醇提水沉法等［22］。李会军等［23］、吉腾飞等［24］用乙醇作溶剂从金银花及欧橄榄叶中得到提取物，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，乙酸乙酯部分采用反复硅胶柱层析进行分离、纯化，得到两个新的裂环环烯醚萜类化合物。许敏等用甲醇提取植物干燥叶，用正己烷－甲醇、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。萃取部分经硅胶柱层析，梯度洗脱，得到20种新的裂环烯醚萜苷［25～29］。

内酯化合物在热碱液中会开环成盐，而溶于水中。酸化后会闭环，析出原内酯化合物。碱提取酸沉淀法是利用该特性可提取倍半萜类内酯化合物。但是当用酸、碱处理时，可能引起构型的改变，应引起注意。

吸附方法主要分为两种。一种为活性炭吸附法，另一种为大孔树脂吸附法。徐泽红等［30］、蔺建新等［31］、李茂星等［32］、才谦等［33］用不同型号的大孔吸附树脂对植物提取物中裂环烯醚萜苷类成分的吸附与解吸附能力进行实验，研究出树脂的最佳型号、最佳的洗脱溶剂和洗脱体积分离纯化富集植物中的裂环烯醚萜苷类成分。

3.2 萜烯类化合物定性定量分析

国内外有关萜烯类化合物的研究中，其分析方法主要包含高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、电泳法、液质联用色谱法和气质联用色谱法等。萜类化合物中具挥发性精油的部分主要采用气相色谱进行分析，而对非挥发性的二萜、三萜一般采用HPLC，结合适宜的检测器分析。

高效液相色谱法分离效果好且分析速度快，已成为目前应用最为广泛的液相色谱法，其分离模式与检测方法多种多样，并且可以选择不同的检测器如质谱和紫外检测器等。白沙等［34］、林鹏程等［35］、孙菁等［36］都使用该方法测定了秦艽中龙胆苦苷，并检测出萜类成分;有人运用多波长法测定栀子中3类组分，9个成分的含量［37］。但用液相色谱法存在样品前处理繁复、成本高、测定时间长、对检测要求高等缺点。

气相色谱法简便、灵敏、准确、重现性好。前人对银杏叶提取物中萜内酯的分离毛细管柱气相色谱条件做了实验，且用内标法测定了各组分的含量，结果表明，气相色谱法的重现性好，准确度较高。

GC－MS技术综合了质谱和色谱的优点，利用气相色谱分离混合物中的组分，利用高鉴别能力的质谱仪作为色谱流出物的检测器，从而实现对分离出来的组分进行迅速地定量和定性分析。王骏［37］等对侧柏叶中萜烯类化合物进行萃取，并用GC、GC/MS检测。

4 烟草中萜烯类化合物分离与检测

4.1 烟草中萜烯类化合物分离提取

烟草中萜类成分的提取主要包括:溶剂萃取法、水蒸气蒸馏法、顶空分离法、超临界二氧化碳萃取法、固相微萃取法。

溶剂萃取法是烟草中常用的提取香味物质的方法，在萜类成分的提取方面应用广泛。该方法不需要特殊仪器，但萃取效率低，溶剂需要量大，萃取时间长。陈章玉等［38］对云南的烟叶用乙醚提取，并对其香味成分进行了GC/MS分析，共鉴定出50多种成分。

水蒸气蒸馏法较为稳定，但该法需用大量有机溶剂萃取，处理量较大。冼可法等人［39］对河南烤烟烟粉做了水蒸汽蒸馏试验，得到的水蒸汽蒸馏中性物经气相色谱分析和专家评吸，得出组成复杂的结论。

顶空分析法步骤简单，处理方便，但在常温下分离，需要较长的时间。由于存在提取不完全的可能性，所以对香味物质的定量分析不准确。

对于具有良好香气的烟草，超临界流体萃取(SCFE)技术具有明显的优越性。但SCFE目前缺乏充分的数据资料，其设备设计、过程设计、经济预算等通常是凭经验进行，且投资大、运行费用高。

固相微萃取技术的原理与气相色谱的原理相似，其优点是不需要溶剂，分析速度快，操作步骤少。刘江生等人［40］采用固相微萃取—气相色谱—质谱(SPME—GC—MS)法定性分析烟叶和成品烟的挥发性香味成分，共鉴定烟叶中挥发性成分29种，成品烟中的20种挥发性成分。

4.2 烟草中萜烯类化合物分析方法

烟草中萜类化合物的仪器分析方法也有液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、液质联用法和气质联用法等。其中，GC/MS技术在烟草中用来分析萜类化合物最为广泛，尤其是电子技术的飞速发展，使其功能日渐完善，应用领域不断扩大。GC/MS可用来对烟叶表面挥发物和腺体分泌物的主要组成部分进行分析。吴云平［41］等选取不同烟草品种为对象，研究其叶表面提取物特征，用GC/MS分析，结果表明，烤烟叶表面提取物主要包括烟碱、新植二烯、腺毛分泌物和烷烃类，且不同品种提取物成分存在差异;也可用来分析烟草中萜类化合物的致香物质，对香气成分进行定性。朱晓兰等［42］、吴鸣等［43］、唐纲岭等［44］对烟草中多种香味成分用GC/MS进行定性分析，证明了该分析方法具有操作简单、快速、重现性好等特点。

5 展望

烟草是一种吸食嗜好品，独具特色的吸食香味是人们享受卷烟制品的原由之一。在当前，卷烟工业降焦减害工艺中伴随香味物质的损失已成为烟草行业亟待解决的问题，如何在降低烟叶有害成分的同时努力保持卷烟制品的吃味醇和及香气浓郁，已成为烟草科技工作者的研究重点。通过对前人相关萜烯类化合物研究结果进行综述，笔者认为，采用更为有效的烤烟香味物质分离分析方法，解析不同生态条件、不同品种、不同烘烤及醇化工艺对烤烟中各类香味物质、尤其是萜烯类化合物的影响，对提高卷烟原料中香味物质的含量，实现卷烟降焦减害的同时，更好地保持烟草特有的香味具有十分重要的现实意义。此外，全面系统了解烤烟中萜烯类化合物及其降解产物，有可能发现新型烟草香精香料，为卷烟新产品的开发提供理论和实验依据。

［1］周剑丽，邱树毅，陈秀勇.麻疯树中萜类物质的性质及研究进展［J］. 贵州化工，2008，33:11－18.

［2］陈玉坤.萜类天然产物的提取及生产工艺［M］.北京:科学出版社，2009.10.

［3］付佳，王洋，阎秀峰.萜类化合物的生理生态功能及经济价值［J］.东北林业大学学报，2003，31(6):59－62.

［4］ Von Schantz M，Widen KG，Hilitunen R.Structures of some aliphatic monoterpenoids isolated from the essential oil of Ledum palustre L［J］.Acta chemical Scandinavica，1973，27(2):551 －555.

［5］ Lawrence BM，Terhune SJ，Tattje DHE.Chemical composition of the oils of Ledum palustre and Ledum groenlandicum［J］.Int Congr Essent Oils，1974，6:86.

［6］ Milkhaliova NS，Rybalko KS，Konovalova OA.Chemical composition of Ledum palustre［J］.Chemistry of Natural Compounds，1978，14(1):103 －105.

［7］ Yu Y，Gao H，Yao XS，et al.Monoterpenoids from the fruit of Gardenia jasminoides［J］.HelveticaChimica Acta，2010，93(12):763 －771.

［8］ Chen QC，Youn U，Bae K，et al.Pyronane monoterpenoids from the fruit of Gardenia jasminoides［J］.Nat Prod，2008，7(1):995－999.

［9］ Lee JH，Yang HY，Lee HS，et al.Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from cones of Pinus koraiensis［J］.J Microbiol Biotehchnol，2008，18(3):497－502.

［10］张燕，刘涛，罗素琴.杜香属植物的化学成分及药理作用研究进展［J］.内蒙古医学院学报，2010，32(3):29－32.

［11］董娟娥，张靖.植物中环烯醚萜类化合物研究进展［J］.西北林学院学报，2004，19(3):131.

［12］ Kizu H，Sugita N，Tominmori T.Diterpenoid constituents of the leaves of Scutellaria repens Buch.－Ham，Ex D.Don ［J］.Chem Pharm Bull，1998，46(6):998 －1000.

［12］ Li RT，Han QB，Zheng YT，et al，Structureand anti－HIV aetivity of micrandilactones B and C，new nortriterpenoids possessing a unique skeleton from Schisandra micrantha［J］.Chem Commun(Camb)，2005，23:2936－29381.

［13］史宏志，刘国顺.烟草香味学［M］.北京:中国农业出版社，1998.144－146.

［14］ Loughrin JH，Hamiton－kemp TR，Anderson RA，et al.Headspace compounds from flowers of Nicotiana and related species［J］.J Agric Food Chem，1990，38(2):455－460.

［15］ Loughrin JH，Hamiton－kemp TR，Anderson RA，et al.Glycosidically bound volatiles components of Nicotiana sylvestris and N.suaveolens flowers［J］.Phytochem，1992，31(2):1537 － 1540.

［16］刘宇，颜合洪.烟草致香物质的研究进展［J］.作物研究，2006，(5):470－474.

［17］王瑞新.烟草化学［M］.北京:中国农业出版社，2003.99－144.

［18］朱显灵，潘文杰，陈懿，等.不同品种烤烟鲜叶表面提取物的主要成分分析［J］.中国烟草科学，2011，32(3):51－56.

［19］吴云平，潘文杰，李章海，等.不同品种烤烟鲜叶表面提取物主要成分比较［J］.中国农学通报，2011，27(2):353－359.

［20］孙心齐，赵瑾，王超杰，等.从废次烟叶中提取茄尼醇的研究［J］.河南大学学报(自然科学版)，1995，25(2):37－40.

［21］岑波，段文贵，赵树凯.从废次烟草中提取茄尼醇的新工艺研究［J］.广西大学学报(自然科学版)，2002，7(3):240 －242.

［22］罗玉燕，卢成瑛，陈功锡，等.裂环烯醚萜类化合物研究概况［J］. 食品科学，2010，31(21):431－436.

［23］李会军，李萍，王闽川，等.金银花中一个新的裂环环烯醚萜苷［J］.中国天然药物，2003，1(3):132－133.

［24］吉腾飞，王爱国，杨建波，等.欧橄榄叶中的新裂环烯醚萜［J］.天然产物研究与开发，2007，19(3):361－364.

［25］许敏，王东，张颖君，等.坚龙胆中的一个新裂环烯醚萜甙［J］.云南植物研究，2006，28(6):669－672.

［26］王洋(译).马尔加什药用植物Cassinopsis chapieleri中的新裂环环烯醚萜［J］.国外医学:中医中药分册，2003，25(6):367－371.

［27］肖苏萍(译).日本当药化学成分及裂环环烯醚萜二苷的结构［J］.国外医学:中医中药分册，2005，27(6):43－44.