中药诱导骨髓间充质干细胞多向分化研究进展

2013-01-22胡丹黄秋云黎金浓陈旭征廖联明

中华细胞与干细胞杂志(电子版) 2013年4期

胡丹黄秋云黎金浓陈旭征廖联明

干细胞(stem cell)是指具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的未分化细胞，它能产生出表型与基因型完全相同的子细胞，是机体其他细胞的起源[1]。根据其发展阶段和来源不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）即为成体干细胞的一种，具有多向分化潜能，以其方便易取、体外培养能扩增迅速、无免疫排斥、与宿主组织能良好整合并长期存活等特点受到研究者的关注[2-3]。但BMSC如何分化成为人们所需要的组织或细胞，是目前干细胞研究领域的重点及热点。传统中药有着强身健体、防病治病的作用。近年来，大量试验研究表明多种中药对BMSC的定向分化具有调控作用，不仅为干细胞的定向分化开辟了新的途径，而且有助于了解中药的作用机制，为中药的临床应用提供理论基础。本文就中药对BMSC诱导分化的研究进展做一综述。

一、中药诱导BMSC分化成神经元样细胞

神经元细胞是不可再生的，因而在神经损伤时，给患者治疗带来很大的困难。近年来，随着干细胞研究的深入，人们渴望通过诱导干细胞分化为神经元样细胞来替代损伤的神经元。

已有研究表明BMSC具有在体内外分化为神经细胞的潜能[4]。项鹏等[5]报道用含复方丹参注射液(含丹参和降香)及硫代甘油的培养基分别诱导成人BMSC分化，均诱导出神经元样细胞,免疫组化结果显示Nestin，NF-M及NSE均阳性，而星形胶质细胞标志物GFAP阴性。黄慧等[6]用香丹注射液(含丹参和降香)定向诱导大鼠BMSC分化为神经元样细胞，推测丹参的水溶性成分丹参素的抗氧化作用可能是产生定向诱导的主要原因之一。吴承远等[7]用丹参注射液体外诱导人胚胎和成年小鼠BMSC向神经细胞分化，免疫细胞化学显示Nestin和bⅢ-tubulin呈阳性表达，MBP及GFAP呈阴性表达。王继明等[8]在培养基中加入肌萎灵注射液（由鹿茸、肉苁蓉、人参等药物组成），观察肌萎灵注射液对人BMSC增殖和向神经细胞分化的影响，结果显示，与对照组相比，肌萎灵注射液组NF 200和GFAP阳性细胞数目均明显增多，提示肌萎灵注射液能明显促进人BMSC的增殖和向神经细胞的分化。姚晓衡等[9]报道参芪液(含党参和黄芪)可在体外诱导BMSC分化为神经元样细胞。聂蕾等[10]观察当归红芪超滤膜提取物在体外诱导小鼠BMSC分化成神经样细胞的效果，通过甲苯胺蓝染色，免疫组织化学及免疫荧光检测发现，诱导后的BMSC形态发生神经样细胞改变，NSE，Nestin，NFP及GFAP表达阳性。

此外，还有研究发现，许多中药成分如黄芩苷、枸杞多糖、地黄多糖等可以在体外诱导BMSC分化成神经元样细胞[11-16]。而BMSC诱导分化为神经干细胞或神经元样细胞后可用来治疗缺血性脑损伤[17]、帕金森综合征[18-19]及缺血缺氧性脑损伤[20]等，为神经系统疾病的治疗带来了希望。

二、中药诱导BMSC分化为成骨细胞

“肾主骨生髓”，“肾藏精、精生髓”，BMSC向成骨分化的能力与中药治疗骨折、骨质疏松症、骨坏死、骨缺损等骨相关疾病有理论上的相通性，基于这一中医理论，Chen等[21]用补肾中药淫羊藿对BMSC向成骨细胞分化进行了初步的研究。淫羊藿苷可以增强骨密度，其作用机制之一是刺激BMSC向成骨分化。Zhang等[23]发现淫羊藿总黄酮可以促进人BMSC向成骨分化，增加细胞碱性磷酸酶（ALP）的释放和矿化作用，抑制BMSC产生破骨细胞，其机制是由于淫羊藿苷促进了BMP-2，BMP-4，Runx2，β-catenin和 cyclinD1的 mRNA 表达，而这些蛋白恰恰是BMP或Wnt-信号通路的调节因子。同时淫羊藿苷促人BMSC成骨分化作用可以被BMP或Wnt-信号通路的经典抑制剂noggin和DKK-1所阻断，进而推断淫羊藿苷是通过BMP或Wnt-信号通路来实现其促进人BMSC向成骨细胞分化作用[22-23]。淫羊藿具有潜在对抗骨质疏松的活性，可不受血中雌激素水平的限制，发挥类似雌激素的作用，增加去卵巢大鼠的骨形成，抑制骨破坏。淫羊藿这种治疗作用是通过调节核结合因子alpha 1(core binding factor alpha 1,Cbfa1)，进而促进成骨祖细胞的分化及调节成骨细胞的活性[24-25]。

除了淫羊藿外，曾建春等[26]用肉苁蓉含药血清诱导后，ALP染色阳性，第12天可见白色钙结节，第20天茜素红染色阳性，说明BMSC在肉苁蓉含药血清诱导下可向成骨细胞分化。董群伟等[27]研究发现牛膝含药血清可促进人BMSC增殖，并能上调成骨转录因子MSX2的表达，但ALP与骨钙素的表达没有变化。许春姣等[28]研究亦发现黄芪含药血清具有增进BMSC增殖和成骨分化的作用。这说明单味补肾中药均有不同程度促进BMSC骨向分化的作用。

经典的补肾壮骨中药复方对BMSC向成骨分化亦有影响，表现为ALP活性升高，钙化结节的形成和骨钙素的表达。范红旗等[29]利用中药血清药理学方法，观察了复方接骨中药（由大黄、当归、骨碎补、川断、熟地等中药组成）含药血清对体外培养的BMSC增殖及向成骨细胞方向分化的影响，发现复方接骨中药可以明显增加体外培养的BMSC数目，提高ALP的活性，从而促进BMSC增殖及向成骨细胞分化。史传道等[30]研究发现，补肾活血复方仙花活骨丹颗粒（由丹参，骨碎补等中药组成）可有效抑制地塞米松诱导的BMSC成脂分化进程，提高成骨分化的能力。程志安等[31]研究了补肾益气药健骨二仙丸（由鹿角，龟板，人参等中药组成）联合成骨诱导剂诱导BMSC能够显著提高ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素的表达，加速矿化结节的形成，促进BMSC向成骨细胞分化。曾意荣等[32]研究了不同浓度补肾活血方(由熟地、杜仲、补骨脂、川牛膝等中药组成)对大鼠BMSC体外增殖的影响，发现给药组BMSC数量均比空白对照组明显增多，并与给药浓度呈正相关。

三、中药诱导BMSC分化成心肌细胞

心血管疾病是现代社会危害人类健康的主要疾患之一，心肌细胞被认为是不可再生细胞，一旦发生损害就无法修复。20世纪90年代，证实移植心肌细胞是治疗重型心肌坏死的一个替代途径。而干细胞移植是唯一有希望修复和替代受损组织细胞的治疗手段[33]。大量研究表明，BMSC不仅可以分化为基质细胞，还可以向多种基质细胞以外的细胞分化，如心肌细胞[34]。采用BMSC移植能够有效改善心肌梗死动物的心功能，国内外很多研究机构甚至已将该研究成果应用于临床[35-36]。在诱导BMSC分化为心肌细胞的过程中可以检测到心肌特异性转录因子（Nkx 2·5,GATA-4）和心肌特异性蛋白（cTnT，α-actin，Desmin，MHC）的表达。

三七总皂甙、人参总皂甙、丹酚酸B和黄芪皂苷分别是临床上常用治疗冠心病的药物如三七、人参、丹参、黄芪的有效成分。现代中药药理研究表明,它们都具有抗心肌缺血和预防心肌再灌注损伤等作用[37]。李志泉等[38]用三七皂苷诱导大鼠BMSC后,检测到心肌特异因子β-MHC的表达。杨忠奇等[39]通过对中药进行筛选，使用三七总皂苷在体外也成功诱导BMSC分化为心肌细胞。汪朝晖等[40]用人参总皂苷诱导大鼠BMSC后,发现cTnT阳性细胞,胞质中可见明显的肌原纤维结构,并有心肌肌球蛋白重链表达。三七皂苷、人参总皂苷和黄芪甲苷诱导BMSC转化为心肌样细胞的作用是否与其抗氧化作用及分泌某些诱导因子有关,尚待进一步研究。徐秀梅等[41]在体外分离培养大鼠BMSC,丹酚酸B诱导24 h后，继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定cTnT的表达,荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因 Nkx 2·5，GATA-4，Desmin 和α-actin mRNA的表达,结果显示，诱导后的BMSC均表达cTnT及心肌分化早期因子。李旭[42]等用丹酚酸B、丹参酮ⅡA及二者联合分别对第2代BMSC定向诱导，结果显示，丹酚酸B及丹参酮ⅡA均可分别诱导BMSC获得心肌分化表型，且二者联合诱导效果最好。武重阳等[43]采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第4代BMSC，应用免疫细胞化学、原位杂交组织化学及透射电子显微镜鉴定诱导后的BMSC，结果发现经诱导后，Desmin，α-actin和肌球蛋白重链强表达阳性。杨庆有等[44]用黄芪含药血清诱导大鼠BMSC后，cTnT，Desmin和心肌特异性肌球蛋白表达阳性。此外，廖联明等[45]研究了黄芪甲苷对心肌干细胞的促分化作用，用黄芪甲苷诱导小鼠Sca-1+心肌干细胞，继续培养4周后，免疫组化观察发现，与未诱导组相比，诱导组Destin，α-actin和cTnT均表达阳性。

四、中药诱导BMSC分化成软骨细胞

研究发现，在向软骨诱导的过程中，BMSC一般作为首选种子细胞，部分中药及其有效成分可以促进转化生长因子β1和Ⅱ型胶原的表达，而转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子，适当的中药浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化。Ⅱ型胶原主要存在于软骨中，被用作鉴定BMSC向软骨分化的主要特异性蛋白[46]。

高明珠[47]研究中药骨碎补、熟地体外定向诱导大鼠BMSC分化为软骨细胞的可行性，经免疫组化检测发现，加入骨碎补提取物后，Ⅱ型胶原表达阳性，但加入熟地提取物后，Ⅱ型胶原表达阴性，说明骨碎补提取物可以诱导BMSC分化成软骨细胞，熟地提取物则不能诱导BMSC分化成软骨细胞。李楠等[48]通过细胞染色、透射电子显微镜、免疫组化等实验技术，观察了龟鹿二仙胶汤含药血清在体外对兔BMSC向软骨细胞分化的影响，发现在TGF-β3等诱导下，龟鹿二仙胶汤中药血清可以明显促进软骨表型化BMSC的GAG分泌及Ⅱ型胶原mRNA的表达。汤治黎等[49]用复方丹参注射液体外诱导大鼠BMSC向软骨细胞分化，免疫组化测定各组Ⅱ型胶原的阳性率，发现复方丹参注射液诱导组Ⅱ型胶原的阳性率明显高于空白组，说明复方丹参注射液可以体外诱导大鼠BMSC分化成软骨细胞。吴追乐等[50]研究发现透骨消痛颗粒可以诱导BMSC分化成软骨细胞，增强Ⅱ型胶原的表达。徐凌霄等[51]发现，在BMSC向软骨细胞分化的过程中，左归丸含药血清能增强Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的表达。

五、结语

BMSC因其取材方便，容易纯化，短时间内可以大量扩增，不存在免疫排斥，无伦理道德争议而备受关注。国内外大量实验证明BMSC在特定条件下可定向诱导分化为心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞及神经细胞等，用传统中药作为诱导分化剂具有价廉、安全的优点，可望成为今后BMSC安全有效的诱导分化剂。

尽管近几年来对BMSC的研究取得了很大的进展。关于中药诱导BMSC多向分化的研究亦较多，推测其作用机制主要与抗氧化、清除氧自由基及分泌某些诱导因子等有关，但具体的分子机制还有待进一步研究。对于在体外已证实具有诱导BMSC多向分化的中药是否能在动物模型中诱导移植的BMSC产生定向分化，这些都是亟待解决的问题。相信随着进一步的深入研究，配合传统中医理论，在问题不断解决的同时也许会为中药诱导BMSC定向分化提供新的思路和方法，为中医药现代化研究和临床应用提供帮助。

1 Gong FL. Medical Immunology [M]. Vol Ⅱ. Beijing:Science Press, 2004.

2 Bernardo ME, Locatelli F, Fibbe WE. Mesenchymal stromal cells[J]. Ann N Y Acad Sci, 2009, 1176:101-117.

3 Deng W, Obrocka M, FisherⅠ,et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP[J]. Biochem Biophysic Res Commun, 2001,282:148-152.

4 Ding, D. C., Shyu, W. C., Chiang, M. F.,et al. Enhancement of neuroplasticity through upregulation of beta1integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model[J]. Neurobiol. Dis, 2007, 27(3):339-353.

5 项鹏,夏文杰,王连荣,等. 丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞[J]. 中山医科大学学报, 2001,22(5):321-324.

6 黄慧,唐云安,张成. 香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞[J]. 中药材, 2004,27(8):585-588.

7 吴承远,孟凡刚,王建刚,等. 丹参注射液诱导骨髓基质干细胞定向发育为神经细胞的试验研究[J]. 山东大学学报, 2006, 44(1):25-28.

8 王继明,吴以岭,陈金亮,等. 肌萎灵注射液对人骨髓基质细胞增殖和向神经细胞分化的影响[J]. 中国中医基础医学杂志, 2007, 13(10):768-770.

9 姚晓衡,刘卫彬,柳太云,等. 参芪液对成人骨髓基质干细胞的诱导分化作用[J]. 中国神经精神疾病杂志,2004, 30(3):211-213.

10 聂蕾,殷祎隆,刘永七,等.当归红芪超滤膜提取物诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志, 2013, 33(5):632-637.

11 贾延吉,杨于嘉,宋元宗.黄芩苷体外诱导大鼠骨髓基质细胞称为神经细胞[J]. 中国病理生理杂志, 2002,18(3):247-249.

12 刘霞,单伟,曾瑞霞,等.枸杞多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(14):2667-2672.

13 蔡光先,刘柏炎,林琳,等.地黄多糖诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞最佳浓度探索[J]. 中国中医急症, 2007, 16(2):206-208.

14 陈兵,尹延庆,柯俊龙,等.川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞：最佳诱导剂量筛选[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14（6）1072-1077.

15 李会忠,廖联明,张国锋,等.中药诱导大鼠间充质干细胞向神经干细胞分化研究[J]. 福建中医药, 2012,43(5):46-48.

16 裴晶晶,吴润,赵红斌,等. Ca2+信号介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(10):1808-1812.

17 DENG Zhi-f eng,Yang Wang,SONG Shu-xin,et al.Angiogenesis and neural progenitor proliferation induced by intracarotid Administration of mesenchymal stemcells in rats with cerebral ischemiap[J]. China Medical Abstracts(Surgery), 2005, 14(3):235-240.

18 王晓萃,李鑫,付文玉,等.骨髓间充质干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠模型[J]. 中国实验动物学报, 2009, 17(2):131-134.

19 叶民,陈生弟,汪锡金,等.体外诱导骨髓基质干细胞治疗帕金森病大鼠模的研究[J]. 中华神经科杂志,2005, 38(10):624-627.

20 胡燕琳.丹参诱导骨髓间充质干细胞神经性分化治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤[D]. 重庆医科大学, 2008.

21 Chen KM, Ge BF, Ma HP, et al. Icariin, a flavonoid from the herb Epimedium enhances the osteogenic differentiation of rat primary bone marrow stromal cells[J]. Pharmazie,2005, 60(12):939-942.

22 Chen WF, Mok SK, Wang XL,et al. Total flavonoid fraction of the Herba epimedii extract suppresses urinary calcium excretion and improves bone properties in ovariectomised mice[J]. Br J Nutr, 2011, 105(2):180-189.

23 Zhang JF, Li G, Chan CY, et al. Flavonoids of Herba Epimedii regulate osteogenesis of human mesenchymal stem cells through BMP and Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Mol Cell Endocrinol, 2010, 314(1):70-74.

24 Xie F, Wu CF, Lai WP, et al. The osteoprotective effect of Herba epimedii (HEP) extract in vivo and in vitro[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2005, 2(3):353-361.

25 Qian G, Zhang X, Lu L, et al. Regulation of Cbfa1 expression by total flavonoids of Herba epimedii[J]. Endocr J, 2006, 53(1):87-94.

26 曾建春,樊粤光,刘建仁,等.肉苁蓉含药血清诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究[J]. 中国骨伤, 2010, 23(8):606-608.

27 董群伟,孙奋勇,王华.牛膝含药血清对体外培养人间充质干细胞增殖与分化的影响[J]. 广东药学院学报,2006, 22(2):185-187.

28 许春姣,翦新春,成红泉,等.黄芪对兔骨髓基质细胞增殖和向成骨细胞分化的影响[J]. 中南大学学报:医学版, 2004, 29(4):489-491.

29 范红旗,孙辉生,刘振旗,等. 复方接骨中药对骨髓间充质干细胞体外增殖及向成骨细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2007, 10(2): 1818-1825.

30 史传道,杨晓航,于远望,等.仙花活骨丹颗粒对小鼠MSCs激素诱导分化的影响[J]. 辽宁中医杂志, 2005,32(8):848-849.

31 程志安,宋少云,吴燕峰,等.健骨二仙丸介导间充质干细胞的成骨细胞定向分化诱导及其成骨活性[J]. 中国中医骨伤科杂志, 2005, 13(1):8-11.

32 曾意荣,樊粤光,刘红,等.补肾活血中药对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(8):1581-1585.

33 陈嘉,邹移海,孙京臣,等.胚胎干细胞向心肌细胞分化及中药干预研究[J]. 山东中医药大学学报, 2006,30(5):419-421.

34 Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics[J]. Circ Res, 2004,95(1):9-20.

35 马晓辉,高长青,李伯君,等. 骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究[J]. 中华医学杂志, 2009,89(15):1067-1070.

36 Hare JM, Traverse JH, Henry TD, et al. A randomized,double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells(prochymal) after acute myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardiol, 2009, 54(24):2277-2286.

37 兰萍,刘颖,李小波,等.红花注射液治疗肺心病心力衰竭疗效观察[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(4):1026-1026.

38 李志泉,冼绍祥,汪朝辉,等.三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响[J]. 广州中医药大学学报, 2007, 24(6):470-474.

39 杨忠奇,冼绍祥,汪朝晖,等.三七总皂苷对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用[J]. 中药新药与临床药理, 2006, 17(4):239-242.

40 汪朝辉,冼绍祥,杨忠奇,等.人参总皂苷诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J]. 广州中医药大学学报, 2006, 23(2):100-103.

41 徐秀梅,郭茂娟,赵旭,等.丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(3):574-576.

42 李旭,王亚玲.丹酚酸B及丹参酮ⅡA诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013,17(10):1849-1855.

43 武重阳,孙兰军,赵英强,等.复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[J]. 中国老年学杂志, 2010, 30(16):2328-2330.

44 杨庆有,冼绍祥,孙慧茹,等.黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J]. 辽宁中医杂志, 2008, 35(6):832-834.

45 廖联明,郑友生,江敏,等.黄芪甲苷促进心肌干细胞分化的作用研究[J/CD]. 中华细胞与干细胞杂志, 2011,1(1):52-56.

46 李丽艳,黄金中,杜江.转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(1):38-41.

47 高明珠.中药骨碎补、熟地诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的研究[D]. 大连医科大学, 2007.

48 李楠,王和鸣,李文顺,等.龟鹿二仙胶汤含药血清对兔体外BMSCs向软骨细胞分化的干预作用[J]. 上海中医药大学学报, 2007, 21(6):58-61.