壳聚糖及其衍生物在牙周病学中的应用进展

陈琴男 赵翚

●综 述

壳聚糖及其衍生物在牙周病学中的应用进展

陈琴男 赵翚

壳聚糖在自然界中来源丰富，价格低廉，且具有较好的生物活性、生物相容性、生物降解性，并易于制成溶液、膜、胶体等各种剂型[1]，在医学领域被广泛应用。壳聚糖及其衍生物因具有抑菌性、可做缓释药物的载体、能促进牙周组织的生长和修复、骨再生等特性，在牙周病学领域越来越被关注。现对壳聚糖及其衍生物在牙周病学中的应用进展作一综述。

1 壳聚糖及其衍生物的生物基础研究

1.1 生物相容性和降解性 壳聚糖是从自然界甲壳类动物外壳中的甲壳素 [B-（1-4）聚-2-乙酰胺基-D-葡糖]脱乙酰化制得，壳聚糖通过溶菌酶代谢后成为无毒的D-氨基葡萄糖,作为一种抗菌酶存在于人类唾液中。已有文献报道，壳聚糖具有良好的性质如生物黏附性、通透性、生物相容性和生物降解性[2-4]。

Peh等[2]使用醋酸和乳酸溶液方法制备醋酸化壳聚糖和乳酸化壳聚糖，并用纹理分析仪检测醋酸化壳聚糖、乳酸化壳聚糖的机械强度和体外黏附强度。乳酸化壳聚糖比醋酸化壳聚糖表现出更低的抗拉强度，但更加柔软、生物黏附性能更强。乳酸化壳聚糖无刺激性，不会导致皮肤过敏反应，进行血液注射测试也无明显的不良反应。但醋酸化壳聚糖可造成皮肤不良反应，如出现红斑、水肿及系统毒性。因此，Peh等人认为乳酸化壳聚糖膜适合在伤口愈合及皮肤烧伤上的临床应用。

Dodane等[3]建立caco-2单细胞模型，壳聚糖引起可逆的、时间和剂量依赖性的跨上皮电阻抗的衰减。壳聚糖对紧密连接的作用通过转运甘露醇增加的渗透系数来证实，当细胞以0.1%～0.5%w/v壳聚糖溶液处理60min后较对照组细胞的渗透系数明显增加。Vande-Vord等[4]将多孔壳聚糖支架植入小鼠体内，然后于1、2、 4、8或12周后处死动物，组织学检查显示：经标记的中性粒细胞积聚在植入的多孔壳聚糖支架中，随着植入时间的推移，壳聚糖支架逐渐降解；革兰染色和鲎试剂检测显示无感染或产生内毒素的证据；壳聚糖孔隙内可见胶原蛋白，表明结缔组织基质沉积在壳聚糖支架内；外部植入物多孔壳聚糖支架表面也观察到相关的血管生成活性。这一研究表明，壳聚糖在动物模型上具有高度的生物相容性和生物降解性。

1.2 抑菌性 有学者报道，壳聚糖对大部分口腔病原体有抗菌性包括牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、放线伴放线杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、绿脓杆菌[5-8]。虽然壳聚糖如何显示出具体的抗菌作用还不清楚，可能原因在于壳聚糖的质子化作用和积极吸引带负电荷的细菌细胞壁。两项功能之间的相互作用导致细菌细胞壁破裂，细胞质泄漏，最终导致细菌死亡。Andres等[9]认为，壳聚糖的抗菌机制是通过其游离氨基酸群体来破坏细胞壁实现的。Chung等[6]发现，壳聚糖对大肠杆菌的灭活通过两个步骤的顺序机制发生：首先是细胞膜和细胞壁的初步分离，其次是破坏细胞膜。Ikinci等[3]发现大分子量的壳聚糖对牙龈卟啉单胞菌抗菌性更强。还有学者发现，分子量越大和壳聚糖的脱乙酰程度越高，壳聚糖的抗菌活性越强[5，10]。然而，增加的脱乙酰程度会引起溶菌酶生物降解的减少。

Chen等[7]对壳聚糖对6株包括3种革兰阴性和3种革兰阳性细菌的抗菌活性进行了研究，并且对壳聚糖的抗菌活性与壳聚糖的脱乙酰度、浓度和分子量的相关性进行评估，壳聚糖显示出对绿脓杆菌固体的琼脂抗菌活性最高。当细菌被栽培液体发酵液中发现类似的倾向。高脱乙酰度和壳聚糖的浓度高，导致较高的抗菌活性。壳聚糖的分子量的不同对细菌的抑制效果的影响是依赖于细菌的种类。大肠杆菌在其死亡阶段和对数的阶段对壳聚糖分子量的不同而抗菌效果不同表现明显。认为壳聚糖的抗菌机制可以通过细菌表面的电荷和细菌和壳聚糖接触时间的持续性来解释。No等[10]对壳聚糖的抑菌活性和6种不同分子量的壳聚糖低聚物（Mws）进行测试，壳聚糖显示出比壳聚糖低聚物更高的抗菌活性，而且明显抑制大部分受试细菌的增殖，虽然不同分子量的壳聚糖与细菌种类的不同所显示的抑制效果也不同，0.1%壳聚糖普遍表现出对革兰阳性细菌比对革兰阴性细菌更强的抗菌效果。壳聚糖作为溶剂，1%醋酸抑制绝大多数受试细菌生长是有效的，除了乳酸菌，因为1%乳酸或蚁酸能更有效的抑制乳酸菌。壳聚糖的抑菌活性与pH值（pH测试范围值4.5～5.9）呈负相关，在较低的pH值下壳聚糖的抑菌活性更高。Bae等[11]研究发现，壳聚糖表现出有效抗变形链球菌的作用，并在4d的菌斑再生模式中显示处重要的抗菌和抗菌斑作用。

1.3 作为缓释抗菌药物的载体 Bernardo等[12]和Shen等[13]的体外实验研究表明，壳聚糖可以作为缓释抗菌药物的载体。 Tig li等[14]通过制备壳聚糖支架，在支架里载入地塞米松或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)。在杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）里载入900ng地塞米松的壳聚糖支架以一个均匀的速度释放地塞米松，持续5d全部释放。bFGF在所有的壳聚糖支架（50ng或100ng）均在10～20h内释放完。

Tada等[15]的实验结果表明，壳聚糖膜含有羟基荧光素和荧光紫杉醇载入的PLGA NPs显示出双相释放特性。在释放的第一相，78%的CF和34%的NPs在短短数日内释放。在第二相，释放变得缓慢，其后3周释放出额外的22%的CF和18%的NPs。扫描电镜图像和动态光散射测量表明，NP释放取决于膜降解率。FPTX-loaded PLGA NPs表明药物总量的19.8%在2d内释放，接下来的26d内未检测到额外的释放。因此认为，壳聚糖膜具有包含PLGA NPs的能力并形成近乎完美的表面覆盖层，并且能综合并释放两个有着不同的亲水性的药物，这是一种有前途的局部缓释药物释放平台。

1.4 成骨作用 Bhat等[16]通过动物实验观察壳聚糖在骨再生中的作用。其将从黑豚鼠股骨和大鼠的胫骨培养得到的间充质干细胞播种在壳聚糖微粒上，通过在体外培养干细胞附着的实验使细胞黏附在微粒上5、10、20、30h，间充质干细胞黏附在微粒上的荧光图像在24h或48h取得，使用活/死细胞检测。间充质干细胞/成骨细胞播种在微粒上然后使用成骨媒介进行体外培养，并且植入到部分骨缺损的大鼠股骨上。在体内研究中将大鼠分成实验和对照两组，每组4只。实验组植入以间充质细胞为种子的微粒，并在4和8周分别观察；对照组只植入支持缺陷的不锈钢板。股骨在植入4和8周后取出，通过造影、显微CT、组织学来评估骨缺损位点的骨形成。实验组在植入8周后观察到有明显的骨形成增加。这项研究的结果表明，壳聚糖微粒被证明是一种很好的骨再生的生物材料。

Yeo等[17]的动物实验发现壳聚糖膜可以使牙骨质和牙槽骨再生。Jung等[18]将酸和聚乙醇酸植入大鼠颅骨缺损上，壳聚糖膜手术植入在第2、8周局部骨形成得到加强。因此得出壳聚糖膜涂以聚乙醇酸有一个重要的潜能导致大鼠颅骨缺损模型的骨形成。但聚乙醇酸的剂量范围和观察间隔对骨形成无明显差异。Pramanik等[19]将一种新的生物模拟羟基磷灰石/壳聚糖磷酸盐纳米复合体用一种溶液为基础的化学方法合成，其中的羟基磷灰石的含量为10%～60%（w/w），羟基磷灰石和磷酸化壳聚糖的界面粘合，通过傅里叶变换红外吸收光谱分析和X射线衍射研究。复合材料的表面形态及纳米粒子在聚合体基质的均匀分散进行了研究，分别通过扫描电子显微镜、透射电镜来研究。发现随着羟基磷灰石在纳米粒子中的含量提高，复合材料的机械性能有了极大改善。通过对小鼠L929成纤维细胞进行了细胞毒性试验，确认了纳米复合材料的细胞相容性。小鼠成骨细胞初步培养研究证明，纳米复合材料的骨细胞相容性和很高的体外成骨性。磷酸化壳聚糖的使用促进了复合体基质内微粒的均匀分布，通过悬吊的磷酸盐组团与微粒复合体之间的界面相互作用。这种由单一的微结构组成的生物模拟羟基磷灰石/壳聚糖磷酸盐纳米复合体可用于骨组织工程。

1.5 屏障膜作用 临床上采用屏障膜阻止牙龈组织增长远离根面，为有缺陷的组织提供了一个孤立的空间区域，使得相对较慢增长的牙周韧带成纤维细胞重新增殖到牙根面。Kuo等[20]使用3种类型的壳聚糖膜（Chi-NaOH、Chi-Na5P3O10和Na2SO3），在标准化、成骨的和临界成年大鼠头骨缺陷区覆盖了特别准备的壳聚糖膜。4周后观察到骨愈合程度壳聚糖膜组与对照组有明显的不同。壳聚糖的覆盖区域显示结缔组织和骨组织边界间有一个清晰的空间。显然，这个过程对细胞阻塞和对骨组织成骨是有益的。对照组骨缺损区充满了结缔组织，观察到其对完整的新骨形成破坏。

牙周膜细胞在牙周组织的再生中起到至关重要的作用，而且未分化的间充质细胞亚群被认为是存在于人群中的。Inanc等[21]进行了体外实验，将牙周韧带成纤维细胞(hPDLFs)封装在350～450μm范围的壳聚糖/羟基磷灰石微球内，其目的是评估人hPDLFs封装在壳聚糖羟基磷灰石微粒（C/HA）中这种三维成骨培养环境下的成骨分化潜能。结果证明，hPDLFs在体外诱导，不管是二维还是三维培养条件下，都具有成骨细胞分化能力。在微重力生物反应器里的C/HA微粒可能成为作为一个合适的三维环境以支持hPDLFs的体外成骨分化。

2 壳聚糖及其衍生物在牙周病治疗中的应用

Boynuegri等[22]将20个慢性牙周炎患者随机分为4组：壳聚糖凝胶组（1%w/v）、壳聚糖凝胶（1%w/v）+脱矿的骨基质组、壳聚糖凝胶（1%w/v）+胶原膜组、只接受翻瓣术组（对照组），通过术前及术后90、180d临床和影像学检测发现，3组临床检测指标无明显差异，但影像学检测提示除了对照组其他组有明显的差异；与术前比较，不管是使用壳聚糖、壳聚糖与脱矿的骨基质、还是壳聚糖与胶原膜的复合物都是有前景的牙周再生材料。Aklnclbay等[23]的研究显示，对慢性牙周炎患者，在牙周基础治疗后（包括刮治和根面平整），用壳聚糖胶体的浓度（1%w/w）含有或不含有15%的甲硝唑作为牙周局部用药，壳聚糖本身和壳聚糖与甲硝唑的联合制剂是一样有效的，原因系壳聚糖本身具有抗菌特性。

3 结语

壳聚糖及其衍生物生物学特性良好，在牙周病学领域将有很好的应用前景。由于壳聚糖在牙周疾病的治疗中大多处于实验室和动物实验研究阶段，相信在不久的将来，依靠多学科联合应用，将能以一种合适的药物配比和剂型应用于临床，并实现规模化的临床应用。

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2012-06-18）

（本文编辑:欧阳卿）

温州市医药卫生科学研究项目（2011B018）

325000 温州医学院温州市第三临床学院（温州市人民医院）

赵翚，E-mail：wzzh009@163.com