腹腔镜胃癌根治术患者外周血CK19mRNA的变化及意义

倪开元 徐鲲杰 洪晓明 汪东杰

腹腔镜胃癌根治术患者外周血CK19mRNA的变化及意义

倪开元 徐鲲杰 洪晓明 汪东杰

目的 探讨腹腔镜胃癌根治术患者外周血CK19mRNA的变化及意义。 方法 采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术检测CK19mRNA在腹腔镜组（14例）及开腹组（37例）胃癌根治术外周血的表达情况。结果 两组间仅手术时间差异有统计学意义（P＜0.01），术中失血量及清除淋巴结数的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。腹腔镜组患者手术前后CK19mRNA的表达无明显变化（P＞0.05）。开腹组患者手术前后CK19mRNA的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。开腹组术后CK19mRNA阳性表达患者明显多于腹腔镜组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 与开腹手术相比，腹腔镜胃癌根治术可以降低静脉血CK19mRNA的阳性率，减少术后肿瘤血循微转移的危险性。

腹腔镜 胃癌 微转移 细胞角蛋白19 mRNA

目前，尽管腹腔镜胃癌根治术技术日趋成熟，在胃癌高发的亚洲地区应用越来越广泛，但其对患者术后血循环微转移的影响仍不完全确定，尚存在争议。本研究采用FQ-PCR技术检测腹腔镜胃癌根治术患者手术前后外周血细胞角蛋白19（CK19）的表达情况，旨在探讨腹腔镜胃癌根治术对肿瘤细胞血循环微转移的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2009-06—2011-03收治的胃癌患者51例，术前均常规行电子胃镜活检或超声胃镜检查，明确病变部位及病理类型，病理检查确诊为胃癌。术前常规行胸片、心电图、腹部超声及全腹部CT平扫+增强检查，无肝脏及其他部位转移征象。排除TNM分期Ⅳ患者。其中采用腹腔镜胃癌根治术治疗14例（腹腔镜组），男11例，女3例；年龄37～68（58±11）岁；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期5例，Ⅲ期7例；肿瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。采用开腹手术治疗37例（开腹组），男31例，女6例；年龄49～77（63±12）岁；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期19例；肿瘤部位：胃上1/3者3例，胃中1/3者1例，胃下1/3者10例。两组患者性别、年龄、TNM分期及肿瘤部位的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 手术方法 两组患者均遵循无瘤原则进行手术，严格按照肿瘤根治原则进行手术操作，淋巴廓清均为D2程度。两组手术均由同一组医师实施。

1.2.2 标本处理 两组患者均于手术当天术前行颈内静脉深静脉置管，在全麻达成后不同时段[手术开始前、气腹撤除后（腔镜组）、关腹后（开腹组）]进行采血。弃去注射器抽取的前5ml血液，以减少标本污染，再抽取5ml血液加入消毒肝素抗凝冷冻管，术后标本2 000r/min离心10min，立即放入-80℃低温冰箱冻存，而后统一检测（标本采集后2d内完成）。

1.2.3 FQ-PCR检测

1.2.3.1 外周血单核细胞的提取 取出血液标本，于电热恒温水槽快速解冻。将5ml抗凝外周血加入等体积0.9%氯化钠注射液稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4℃静置5min后，2 000 r/min离心10min，吸取白细胞层（勿吸取底部红细胞层）于1.5ml离心管中，12 000r/ min离心5min，弃上清液，沉淀加入1ml0.9%氯化钠注射液轻轻吹打均匀，12 000r/min离心5min，弃上清液，留取沉淀备用。

1.2.3.2 细胞总RNA提取 沉淀加入1ml RNA提取液（Trizol），充分混匀。室温静置5min，加入0.2ml氯仿，封盖后用力振摇 15s，4℃静置 5min，而后 4℃下 12 000r/min离心10min，离心后反应管分3层，底层为氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇轻轻混匀4℃静置10min，然后4℃下12 000r/min离心15min（离心前通常未见RNA沉淀，离心后可见胶状沉淀）。弃上清液，加入1ml75%的乙醇(注：75%乙醇配制时须用DEPC H2O）洗涤RNA沉淀，4℃下7 500 r/min离心5min，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10min。用40μl DEPC H2O溶解沉淀，-80℃保存备用。

1.2.3.3 逆转录反应 取灭菌0.2ml离心管配备逆转录体系，Oligo（dT）18Primer 1μl、DEPC-treatedWater 6μl、提取的RNA 5μl，70℃下5min后立刻置于冰上1min。紧接上一步，5×Reaction Buffer 4μl、RiboLock RNase Inhibitor 1μl、10mmol/LdNTP mix 2μl，37℃下5min后立刻置于冰上1min。立即取RevertAidTMM-MuLVRT 1μl，于42℃下60min、70℃下10min后-80℃保存。

1.2.3.4 试剂配制 从试剂盒中取出CK19反应液，在室温下融化并振荡混匀后，2 000r/min离心10s。计算需准备反应数n[n=样本数+1（阴性对照）+1（阳性对照）+4（定量标准品）]。测试反应体系配制方法：CK19反应液44μl，Taq酶1μl。计算上述各试剂的使用量，加入离心管中，充分混匀后，按45μl量分别分装到不同的PCR反应管中，反应管中分别加入5μl的阴性对照、阳性对照、逆转录好的cDNA及定量标准品（标准品需倍比稀释成107、106、105、104），瞬时离心准备上机。

1.2.3.5 实时定量PCR扩增及结果分析 将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：预变性93℃30min，然后93℃45s、55℃60s共40个循环。选择在第二步第二阶段采集FAM荧光信号进行检测。反应结束后保存检测数据文件。调节baseline cycle至2～15，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的值。检测样本Ct≤37.0者判为阳性，Ct＞37.0者重测，重测结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料均以表示，组间比较采用t检验，率的比较用χ2检验或Fisher确切概率法。

2 结果

2.1 两组患者手术情况的比较 腹腔镜组手术时间255～345（280±73）min，术中失血量60～200（100± 30）ml，清除淋巴结11～24（12±3.5）枚；开腹组手术时间150～255（160±58）min，术中失血量100～400（110±40）ml，清除淋巴结11～29（13±2.5）枚。两组间仅手术时间差异有统计学意义（P＜0.01），术中失血量及清除淋巴结数的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2.2 两组患者手术前后外周血CK19mRNA的表达情况 腹腔镜组患者术前外周血CK19mRNA阳性5例（35.71%），阴性9例；术后阳性6例（42.86%），阴性8例（57.14%）；手术前后CK19mRNA的表达无明显变化（P＞0.05）。开腹组患者术前外周血CK19mRNA阳性13例（35.14%），阴性24例；术后阳性25例（67.6%），阴性12例（32.4%）；手术前后CK19mRNA的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。开腹组术后CK19mRNA阳性表达患者明显多于腹腔镜组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

微转移通常是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，扩散并存活于血循环、骨髓、淋巴系统、肝及肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，能够逃避免疫监视、侵犯血管和发展成为肉眼可见的病变。一般情况下，常规检查方法如B超、增强CT扫描、核磁共振成像、单克隆抗体放射免疫显影技术、普通病理检查都很难发现。目前认为，临床转移是由微转移发展而来，但肿瘤细胞进入淋巴管和血管后并不意味着一定都会发生转移，最终仅有少数微转移能发展为临床转移。

CK19是Ⅰ型细胞骨架中中间纤维的一种，具有严格的组织特异性。其局限表达于胃肠上皮细胞，在所有的胃癌组织中几乎都明显表达，且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定[1-2]。Fujita等[3]的研究显示，较之CK18、CK20和CEA，CK19是检测胃癌血循环微转移的更好的标志物。检测胃癌患者外周血液微转移CK19可提高胃癌临床分期的准确性，帮助综合判断患者的预后，且可能有助于早期诊断胃癌远处脏器微小转移，指导术后辅助治疗的选择[4]。

目前，尽管FQ-PCR方法具有较高的敏感性，对肿瘤细胞的检出率较高，但采用FQ-PCR方法或其他方法检测出的血循环中的肿瘤细胞或微转移灶对判断癌症患者的预后有无影响尚无定论，因为癌细胞在血液循环中的播散并不等于一定会出现转移癌，无临床转移癌也不等于无癌细胞播散。胃癌细胞或微转移灶若存在于血液循环中，仍旧增加了胃癌复发及远处转移的危险性，其也是形成临床远处转移的先决条件，因此可以通过监测外周血中的CK19mRNA来观察胃癌患者血循环微转移的变化。

有研究表明，CK19mRNA在胃癌外周血中的阳性表达率为38.4%～77.35%[5-7]。而本研究结果显示，胃癌患者术前外周血中CK19mRNA的阳性表达率为31.37%，低于文献报道，这可能与检测方法、检测试剂以及入选病例不同有关。腹腔镜组患者手术前后外周血CK19mRNA阳性表达率无明显变化，而开腹组术后外周血CK19mRNA的阳性表达率明显上升，提示腹腔镜手术并未显著增加血液CK19mRNA阳性表达率，较之开腹手术可以降低静脉血CK19mRNA的阳性表达率，减少术后肿瘤血循微转移的危险性。笔者认为，腹腔镜手术在操作中通过影像系统使术野有一定的放大效应，可以使解剖更精细，术中用抓钳对少量组织抓持进行暴露，游离过程中对肿瘤的机械性刺激小，超声刀的使用在切断管道的同时使其断端闭合，减少了癌细胞播散的机会，有助于减少肿瘤细胞的扩散。现阶段，腹腔镜胃癌根治术仍处于探索阶段，本研究初步证实腹腔镜手术能够减少肿瘤细胞在血循环中的微转移，但临床远期疗效及其对术后肿瘤复发、转移的影响还有待长期随访和多中心临床试验及循证医学证实。

[1]高进,章静波.癌的侵袭与转移基础与临床[M].北京:科学出版社, 2003:2-3.

[2]Fujita Y,Terashima M,Hoshino Y.Detection of cancer cells disseminated in bone marrow using real-time quantitative RT-PCR of CEA,CK19,and CK20 mRNA in patients with gastric cancer [J].Gastric Cancer,2006,9(4):308-314.

[3]Koga T,Tokunaga E,Sumiyoshi Y,et al.Detection of circulating gastric cancer cells in peripheral blood using real time quantitative RT-PCR[J].Hepato Gastroenterology,2008,55(84):1131-1135.

[4]施林祥,李东辉.实时荧光PCR研究新进展[J].世界华人消化杂志, 2005,13(5):596-599.

[5]Kim M A,Lee H S,Yang H K.Cytokeratin expression profile in gastric carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35(5):576-581.

[6]Wheatley S P,Barrett R M,Andrews P D,et al.Phosphorylation by aurora-B negatively regulates survivin function during mitosis[J]. Cell Cycle,2007,6(10):1220-1230.

[7]Ryu K W,Kim Y W,Lee J H,et al.Surgical complications and the risk factors of laparoscopy assisted distal gastrectomy in early gastric cancer[J].Ann Surg Oncol,2008,15(6):1625-1631.

Expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its clinical significance

Gastric cancerMicrometastasis Laparoscopy CK19 mRNA

2012-08-14）

（本文编辑：欧阳卿）

315100 宁波市鄞州第二医院普外科

【 Abstract】Objective To investigate the expression of CK19 mRNA in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection and its significance. Methods The expression of peripheral blood CK19mRNA was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)technology in patients with gastric cancer undergoing laparoscopic radical resection(laparoscopy group,n=14)or laparotomy resection(laparotomy group,n=37).Results The operation time in laparoscopy group was shorter than that in laparotomy group(P＜0.01),while there were no significant differences in e intraoperative blood loss and number of removed lymph node between two groups(P＞0.05).There was no difference in expression of CK19mRNA before and after operation in laparoscopy group(P＞0.05),while there was statistically significant in laparotomy group (P＜0.05).The rate of positive CK19mRNA expression in laparotomy group after operation was higher than that in laparoscopic group(P＜0.05). Conclusion Compared to laparotomy,laparoscopic radical resection of gastric cancer can reduce the positive rate of CK19mRNA expression in peripheral blood and the risk of tumor micrometastasis after operation.