植物多倍体育种的探讨

张红亮，朱永琴，李 霞，姚先玲

（山西省农业种子总站，山西 太原 030006）

植物界中的多倍体极为常见。多倍体是高等植物染色体进化的显著特征，小麦、烟草、棉花、马铃薯、甘蔗等都是自然形成的多倍体。其产生途径可分为有性多倍化和无性多倍化，有性多倍化为植株在有性生殖过程中其小孢子母细胞或大孢子母细胞在减数分裂过程中不减数产生了2n配子，无性多倍化为植株在体细胞分裂过程中发生染色体加倍，而有性多倍化是自然界多倍体形成的主要方式。采用染色体加倍的方法选育植物新品种的途径称为多倍体育种，为倍性育种的一种方式。诱导产生植物多倍体的途径主要有物理诱导法和化学诱导法，而对多倍体的鉴定方法也呈多样化，对相关知识技术的了解，可对多倍体育种实践起到推动和促进作用。

1 物理诱导法

1.1 栽培技术法

在育种研究实践中，育种者常采用田间栽培措施来形成多倍体。最早的物理诱导方式是在番茄上通过打顶而实现的。不过利用栽培技术来形成多倍体的方法效率低下，成效不大。

1.2 条件胁迫法

改变植物生长的外部环境，以使其内部产生改变。如利用外界温度变化（高温、低温、变温处理）、干旱胁迫、水分胁迫处理等诱导产生2n花粉。有研究表明，利用高温处理草木樨，可获得多倍体植株；利用高温或低温处理授粉后的幼胚也可实现染色体的加倍。

1.3 辐照法

可采用电离射线、激变中子、离心力、激光等辐照以实现染色体加倍。用Co射线处理萌动的杜仲种子可以产生多倍体。已在月季、兰花、菊花、大丽花等花卉中应用辐射进行辐照育种，发现在花色、花型、株型上出现有利的变异。但因植物经辐照后改变方向不固定，故导致存在效率低和不稳定的缺点，故此法未能普及。

2 化学诱导法

常用秋水仙素、富民隆、生物碱、除草剂等化学药剂处理正在分裂的细胞以诱导多倍体的产生，其诱导作用专一性强，其中以秋水仙素应用最广。秋水仙素主要作用对象为构成纺锤丝的微管组织，秋水仙素抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，从而使染色体不拉向两极，导致赤道板上的染色体重新复制，最终使染色体加倍。主要有常规诱导法、离体培养诱导法和胚乳培养法等。

2.1 常规诱导法

2.1.1 浸泡法

首先可以浸种。将种子直接浸泡在一定浓度的溶液中作用一定时间，种子可在未发芽前或发芽后浸泡。其次可以浸根。浸根法已经成功诱导出四倍体白菜等。浸泡时间可持续或间隔，其浸泡浓度不同，诱导效果不同。

2.1.2 生长点处理法

此法处理植株生长点的方式多样，可涂抹、可滴注等。如可用1%的秋水仙素羊毛脂制剂滴或涂抹茄子幼苗生长点；还可以用注射器在萝卜幼苗子叶期，用不同浓度秋水仙素点滴生长点进行诱变处理，均可诱导得到同源四倍体。此法需注意所用溶液浓度不可过高，否则植株会受害死亡。

2.1.3 花蕾处理法

此法可诱导出2n配子，选择最佳诱导时期是其关键。如在白菜诱导上，在白菜抽薹期晴天早晨和下午处理花蕾，花蕾大小2.5～3.5 mm，秋水仙素处理浓度为0.05%、0.1%和0.2%。采用微量注射法，每个花蕾注射5～10 μL，每隔 6 h 处理 1 次，处理 1～3 次不等，诱导筛选出了含2n配子较高的二倍体材料。

2.2 离体培养诱导法

此方法把多倍体诱导与组织培养相结合，使得多倍体诱导中融入了组培的优点。该方法目前已在白菜、莴苣等多种蔬菜和大岩桐、马蹄莲、虞美人等众多花卉上取得成功。因所选的植物材料大多幼嫩，故处在分生状态的组织细胞容易受秋水仙素的影响，诱导成功率较高，且可减少嵌合体。其次，由于组培是室内进行的，试验条件易于控制，这就在很大程度上降低了外界环境因素对于试验的干扰和影响。再者，可一次诱导处理大批量的植物材料，更能对诱导成功的材料进行快繁，获得更多的多倍体材料，故大大加快了育种进程，育种效率较高。

2.3 胚乳培养法

胚乳是天然的三倍体组织，因此，胚乳培养可直接获得三倍体植株。胚乳培养目前主要应用在果树、蔬菜、水果和粮食作物中，如猕猴桃、白桑等可直接进行胚乳培养；吴清等以红杨桃成熟干种子为材料，萌发后剥离胚乳进行培养得到的再生植株多数为三倍体，其诱变频率超过70%。但胚乳培养在生产上应用很少，其难点在于被子植物胚乳离体培养通常很难诱导和分化出苗。此外，胚乳愈伤组织在继代培养中染色体数目常表现出不稳定性，再生植株多为非整倍体、混倍体，增加了育种及筛选难度，增加了工作量。

3 鉴定方法

主要有田间观测鉴定法、实验室鉴定法和条件胁迫鉴定法等。

3.1 田间观测鉴定法

即根据植株外部形态特征表现，在田间进行直接观测，筛选多倍体。实践中，主要从叶片特征（叶片形态、叶片大小、叶片厚度等）及花朵特征（花朵大小、花瓣厚度等）等方面着手鉴定。研究可知，四倍体黄瓜叶片面积比二倍体大，且叶片变厚，叶缘皱褶明显，叶色加深。四倍体三色堇花朵巨大，花色艳丽，花斑变大，使其较二倍体三色堇观赏价值有较大的提升。而且不同倍性植株其植株高度、开花期、结实期往往不同，其荚果大小、种子重量及大小往往也有差异，也可从这些方面着手鉴定。

3.2 实验室鉴定法

即在实验室里，试验人员按照一定的试验程序，采用一定的仪器设备，运用一定的试验技术，对疑似多倍体进行筛选，以确认多倍体的方法。

3.2.1 显微镜观测法

主要观测叶片保卫细胞叶绿体数目的特征及叶片气孔特征。四倍体较二倍体叶片保卫细胞叶绿体数目增加，单个叶片气孔增大。这在香蕉、萝卜等植物上都得到了证实。还可对花粉粒进行大小测量，找出区别，以鉴定多倍体。如萝卜四倍体花粉粒较二倍体花粉粒的横径、纵径明显变大，且有不规则形状出现，如圆形；而二倍体萝卜的花粉粒全为规则状，均为狭长型。

3.2.2 染色体鉴定法

主要有根尖染色体制片法及流式细胞仪鉴定法等。其中染色体制片法因可直接见每条染色体的大小、形态及染色体数目，故为倍性鉴定最可靠、最直接的方法，应用广泛。而流式细胞术测量快速，可对细胞倍性进行精确分析，尤其应用于嵌合体的检测上，现在已成功地应用于萝卜、苹果、猕猴桃、李子、番茄等植物上。

3.3 条件胁迫鉴定法

其原理为利用不同倍性的植物因其内部基因组数的不同，故在同一胁迫条件下，其对外界胁迫的反应不同，植株表现出一定的生理生化变化，据此进行鉴定。常有温度胁迫（高温胁迫、低温胁迫）、水分胁迫、盐分胁迫、冻害胁迫、冷害胁迫等。有研究者利用高温和低温胁迫对二倍体西瓜和四倍体西瓜进行了鉴定，且符合程度均高于80%。

4 讨论

4.1 诱导方法

要明确，处理时间因处理方法的不同则不同。诱导多倍体植物其方法具有多样性，而且针对不同的植物生长阶段和不同部位又有其独特性。如0.1%～0.3%浓度的秋水仙素均可诱变获得四倍体萝卜，随着秋水仙素浓度的增高，总变异株率升高，但植株受伤害程度也加大，导致成活率降低。可见植株的特定部位存在一个对药剂浓度耐受极限和最适诱导浓度的问题，这需要科研工作者在科研育种实践中进行试验实践探索，以期有所收获。

4.2 鉴定方法

田间形态鉴定法较易掌握，且简单易行，选择速度快，可以在育种初始选择时应用；而显微镜观测法、根尖染色体制片法、流式细胞仪鉴定法等实验室鉴定法则需要一定的实验人员、实验条件及经费支持，可以在初始选择后需进一步确认筛选时应用；而条件胁迫鉴定法所用时间较长，在实际育种中应用不多。故在育种实践中，要根据植物的特点及其所处的独特生长阶段及实验室试验条件、人员条件和经济因素等方面综合考虑，以寻求最经济高效的鉴定方法。同时也要注意，鉴定方法的划分并非绝对化，而是不能截然分开的，它们之间是有联系的。如根尖染色体制片法中也需用显微镜镜检和照相。育种过程是各种方法灵活综合应用的过程，而随着科学技术的发展，还会有新的鉴定方法出现，如实验室鉴定法又出现了同工酶鉴定法。有研究者经西瓜试验指出，一般表现为随倍性的增加，同工酶活性减低。

4.3 稳定性

诱导易发生嵌合体现象，如没有经过稳定的三色堇变异株移栽大田后却表现嵌合体的性状。对于嵌合体可采用定向选择的方法来稳定四倍体。如可采用分部位、分类别分生繁殖（扦插、嫁接、分别收获有最大变异植株种子和中等变异植株的种子等）的方法来进行逐步选择。育种的中心环节是选择，故可以在大的多倍体群体上进行有效选择，看其长期表现，以得到稳定的多倍体。另外，离体组织细胞染色体加倍可减少嵌合体。而流式细胞术可以针对嵌合体进行定量分析，有助加快嵌合体群体的筛选速度。

4.4 低稔性

刚诱导成功的四倍体其孕性是很低的，这在四倍体萝卜、四倍体白菜中得到了证实。研究者发现，采用适当的育种方法如混合选种、品种间杂交等措施也可使四倍体西瓜孕性提高。而在栽培措施管理上，可以在开花结实期适度减少氮肥的施用，以抑制植株营养器官的生长，而采用增施磷、钾、镁、硼等微量元素，以保证植株生殖器官的营养，促进同化物质由营养器官向生殖器官的集中运转，从而可以提高孕性。

4.5 多倍体育种的独特优势

其一，多倍体育种可作为育种媒介和桥梁，把不能直接杂交的奇数倍植株加倍后变为可以进行杂交的材料。其二，多倍体育种的最终成品往往在产量、品质、抗性上较低倍体高出许多，故为以品质、抗性、产量为育种目标的育种项目提供了一条相对便捷的道路。其三，多倍体育种在花卉育种上独占优势。因多倍体往往表现为巨大性，而花卉的花瓣为其主要观赏部位，若能增加花瓣大小，则能取得更好的观赏效果，较花卉上其他的育种方法更占优势。故可使观赏植物的微观之美放大，使近观为美变为远观为美，如可以设想未来枸杞大型花朵的远观之美。

4.6 育种方法的综合运用

育种分为常规育种及非常规育种法，需要在育种过程中把二者有机结合起来。育种不是孤立的过程，可把杂交育种、系选法、远缘杂交等常规育种方法与分子育种、转基因育种、多倍体育种、辐射育种、分子标记等非常规育种方法相结合，针对实际情况，进行分阶段的选择性应用，灵活性应用，以期达到设定的预期育种目的。

4.7 前景展望

当前，多倍体育种已经在世界各国进行了广泛的研究应用，其涉及到的植物种类众多。植物的多倍体育种可以高效率地改变植物的某些性状，如通过多倍体的巨大性提高产量等，尤其在蔬菜植物及花卉中广泛应用。如已在黄瓜、西瓜、白菜、香蕉、三色堇、兰花、菊花、大丽花等园艺植物上有研究，提高了蔬菜和花卉的品质。如获得的同源四倍体萝卜，其直根维生素C、可溶性蛋白、可溶性糖、还原糖等含量较二倍体提高，而粗纤维和干物质含量降低，营养品质明显改善。也可提高花卉的耐贮运的能力，如四倍体麝香百合花瓣厚实，较二倍体耐贮运。随着现代科学技术的发展，我们有理由相信植物多倍体育种其技术路线会更加成熟完善，其诱导方法、鉴定方法很可能会有突破性的进展，会创制出更多的优良种质资源及优良品种，以更好地服务于育种实践及生产实践。