热休克蛋白表达调控对角膜创伤修复作用的研究进展

徐瓅 张朝然

热休克反应是细胞对于应激及损伤的一种反应。在热休克反应中，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表达上调使得细胞免于死亡。角膜创伤修复是一个极其复杂的过程，目前仍不完全清楚其机制。由于热休克反应及HSP的表达对于角膜创伤修复有着重要的作用，因此，HSP的表达调控已成为研究角膜创伤修复机制以及调控该过程的一个热点。

本文就HSP的表达调控及其对角膜创伤修复作用的最新研究进展作一综述。

1 热休克反应、HSP及其生物学作用

在正常情况下，HSP在细胞中就有表达［1］。在感染、毒物、创伤、缺氧、失水等应激状态下，HSP的表达均可上调［1］。此时，正因为HSP的表达上调，抑制了半胱天冬酶(caspase)的活化，使得细胞免于死亡。因此，当细胞无法产生HSP时，它们将会凋亡。

我们通常所说的 HSP60、HSP70、HSP90分别是大小为60×103、70×103和90×103的HSP。其中，HSP27和HSP90抑制Apaf-1的释放及其与细胞色素 c的结合，从而抑制了caspase 9的活化［2-3］。HSP10和HSP60在线粒体中表达，并与procaspase 3和6结合，使procaspase 3和6仍然保持它们的蛋白质水解能力，从而抑制凋亡［4］。此外，HSP还有分子伴侣的作用，对于蛋白之间的相互作用、蛋白折叠及其合成代谢，并在蛋白跨膜转运中起到重要的作用［1，5］。部分HSP也被认为可通过识别细胞表面的特定蛋白来帮助免疫系统识别患病细胞［6］。

2 调控HSP表达的因素

研究表明，有很多因素或物质可影响及调控HSP的表达，例如感染、创伤、信号转导、分子伴侣化合物等。

HSP对于应激所作出的反应是通过各条信号通路的活化来实现的。由于MAPK——一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布在眼部各种组织中，所以P38MAPK通路是眼部组织中HSP表达调控的一条重要信号转导途径，在应激状态下，MAPK被激活，之后通过此通路使HSP27磷酸化，从而上调其表达。Ono等［7］早在2000年已证明P38MAPK激活与炎症和应激反应的调控密切相关。Meng等［8］的研究表明，P38MAPK信号转导途径参与损伤组织中HSP27的表达调控。

近年来，分子伴侣化合物调控HSP表达，缓解细胞应激，保护细胞免于凋亡的作用被越来越多地报道，并已成为研究热点。

分子伴侣化合物是一种具有伴侣活性的外源性小分子物质，包括苯基丁酸钠(sodium 4-phenylbutyrate，NaPB)、三氧化甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)等。它们可纠正多种错误折叠的蛋白，以及这些蛋白折叠异常所导致的细胞缺陷。正因为分子伴侣化合物具有纠正及稳定蛋白折叠的功能，它们可以缓解细胞的应激，从而保护细胞免于凋亡。

2009年，Chamcheu等［9］报道 TMAO 可减少角蛋白(keratin)突变的原代集落心肌(EBS)细胞中角蛋白的聚集。2011年2月，他们发现TMAO和NaPB都可通过调控HSP70的表达来影响突变的 keratin表达［10］;同年8月，Chamcheu等［11］研究再次证实了这两项发现，并发现即使EBS细胞不处于应激状态，TMAO也可使其HSP70的表达上调，而且HSP70的表达上调可在细胞处于应激状态的时候继续保持，但HSP90的表达并无大幅度的变化，进一步提示TMAO通过上调HSP的表达减少突变蛋白的聚集，从而减轻应激，防止细胞凋亡。2011年，Suaud等［12］报道NaPB可通过Elp2以及STAT-3信号通路刺激人囊性纤维化肺上皮(IB3-1)细胞中HSP70的表达，提示NaPB可能通过上调HSP70的表达，促进ΔF508突变的囊性纤维化跨膜调节基因(cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR)的转运。2012年1月，也有研究［13］表明NaPB可通过刺激HSP70的表达纠正THP突变，从而减轻应激，减少细胞凋亡。

在眼科研究中，分子伴侣化合物也通过调控HSP的表达显现了其纠正蛋白折叠及挽救细胞的功能。例如，在myocilin(MYOC)突变引起的原发性开角型青光眼的细胞模型中，1 mmol/L的NaPB还可减少MYOC在人小梁网细胞内的积聚，提高人小梁网细胞中HSP的表达，缓解细胞应激，从而提高人小梁网细胞的生存率［14-15］。在先天性白内障的研究中，TMAO减少G98R突变αA晶体蛋白(αA-crystallin)在晶状体上皮细胞中的积聚，使晶状体上皮细胞中HSP的表达上调，从而缓解细胞应激，NaPB纠正G165fsX8突变的γD晶体蛋白(γD-crystallin)的错义突变，从而抑制晶状体上皮细胞的凋亡［16-17］。

3 HSP表达对角膜创伤修复作用的研究进展

HSP的表达水平与皮肤创伤修复密切相关，在修复良好的伤口中，HSP呈高表达;反之，在修复不良的伤口中低表达或无表达［18］。在角膜创伤修复的过程中，HSP的表达上调也是细胞自身修复的一部分。

早在20世纪90年代，就有了圆锥角膜的创伤修复中HSP表达的研究。该研究［19］表明，在圆锥角膜及人工晶状体眼的大疱性角膜病变的角膜中，HSP的表达高于正常角膜，提示了HSP在角膜损伤及疾病中的作用。

进入21世纪，各种HSP在角膜创伤修复中的作用被进一步证实，其中，HSP70更是近几年的一个研究热点。

3.1 小分子HSP表达对角膜创伤修复的作用 小分子HSP中，HSP47和HSP27对角膜创伤修复的作用已被证实。

2003年，Miyamoto对新西兰白兔进行准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)，术后 3 d，在角膜上皮细胞和基质层即可检测到HSP47的表达，但在角膜基质及内皮中检测不到。术后5～7 d，HSP47的表达范围扩展到基质深层以及角膜内皮;28 d后逐渐减少，提示HSP47除了在应激时保护角膜细胞，更作为胶原蛋白肽的分子伴侣发挥作用，加快PRK后角膜前基质细胞中胶原蛋白的合成，从而导致角膜基质混浊［20］。之后，HSP47对角膜的保护作用被进一步证实。2004年，Kim等［21］发现诱导HSP47的表达可保护角膜免受热损伤，并且对于加快角膜创伤修复以及准分子激光术后减轻角膜和晶状体的混浊有着重要的作用。

近几年来，HSP27的表达变化也被证实对角膜创伤修复的过程起到重要的作用。2006年2月，Shi等［22］发现在角膜上皮细胞暴露于B波紫外线(UVB)之前加入亚硝酸盐可提高角膜上皮细胞中HSP27的表达并促进其磷酸化，从而减少UVB引起的细胞死亡，及其引起的capases的活化及DNA断裂。在细胞中加入可通过抑制p38MAPK活化来抑制HSP27磷酸化的SB203580之后，亚硝酸盐减少UVB引起细胞死亡的作用被部分逆转。同年9月，他们进一步证实了在正常角膜细胞中，HSP27是以非磷酸化形式存在的，UVB照射后，HSP27迅速磷酸化，提示这种应激反应与HSP27对角膜上皮细胞的保护作用相关［23］。2012年7 月，Jain等［24］发现正常角膜中，磷酸化的HSP27表达只是局限于上皮表面;而当角膜上皮损伤8 h后，它的表达在角膜上皮前缘达到高峰;3 d后在角膜上皮表面及基底层都有表达，并且高于正常角膜;损伤7～14 d后，磷酸化HSP27的表达回落到正常水平，并再次局限于角膜上皮表面。该结果提示，在角膜创伤修复过程中，HSP27的磷酸化及表达变化在细胞迁移及结构重组的过程中起到至关重要的作用。

3.2 HSP70表达对角膜创伤修复的作用 HSP70在近10年都是研究的热点，也使HSP对角膜创伤修复的作用被进一步证实。

2004年，Kim等［25］研究表明，HSP70的表达水平取决于细胞热应激后的恢复时间。在热应激6 h后，HSP70的表达明显上调，细胞的生存率也明显提高，从而证实了HSP70的表达提高具有在氧化应激状态下保护人角膜成纤维细胞的作用，其机制可能为HSP70减轻DNA修复酶的聚合作用，从而防止一氧化氮(NO)介导的细胞内ATP水平的下降。同年，Miya等［26］也证实了角膜激光切削术后角膜基质中HSP70表达的上调及其对角膜的保护作用。

近几年来，也陆续有研究证实了HSP在角膜创伤修复中的重要作用。2008年，Ko等［27］研究探索了纤连蛋白获得性多肽PHSRN对角膜上皮迁移的作用及其对人角膜上皮细胞中HSP70表达的影响。研究发现，PHSRN可以使人角膜上皮细胞中HSP70的表达上调，并且，PHSRN引起的HSP70表达的上调可被SB203580阻断。因此，此项研究提示，诱导HSP70的表达可提升PHSRN对角膜上皮迁移的促进作用，从而促进角膜上皮修复。Mushtaq等［28］于2007年研究了在细胞迁移的不同阶段中HSP70的表达，发现在角膜上皮细胞迁移活跃阶段(角膜上皮损伤48 h内)，HSP70的表达明显增加。该结果提示HSP70可作为分子伴侣调节细胞迁移及角膜上皮增殖，从而起到保护角膜的作用。2011年，他们又发现局部10 μg/mL的HSP70抗体可使角膜上皮修复缓慢，从而再次证实了HSP70在角膜创伤修复中的重要作用［29］。同年，国内也有研究［30］证实了在角膜针刺损伤后1天内，大鼠角膜HSP70的表达水平显著升高，其后逐渐下降，也提示了HSP70是参与角膜创伤愈合的重要分子。2012年，Ma等［31］对人角膜缘上皮细胞的研究表明，将细胞种植在羊膜上可使HSP70超表达，而HSP70的高表达可在UVB及过氧化氢(H2O2)诱导细胞凋亡的条件下提高其生存率。可见，HSP70在角膜上皮创伤修复的过程中也起到非常重要的作用。

3.3 其他HSP表达对角膜创伤修复的作用 除了之前提到的小分子HSP以及HSP70，其他HSP对角膜创伤修复的作用也在近几年有所报道。

2010年，Ebrahimi等［32］研究发现，羊膜可以为原代人角膜缘干细胞在体外的增殖及其表型的维持提供良好的环境，并发现将细胞暴露在空气中后，种植在羊膜上的细胞HSP90的表达高于种植在培养皿上的细胞，提示羊膜可通过上调HSP90的表达起到在应激中保护细胞的作用。可见，各种HSP在角膜上皮创伤修复的过程中均起到非常重要的作用。

4 展望

综上所述，HSP是一类具有分子伴侣作用的蛋白质，在应激状态时，它的表达水平对于细胞的生存起着重要的作用，调控其表达在角膜创伤修复的过程中亦至关重要。在影响HSP表达的因素中，分子伴侣化合物是较为重要的因素，此类物质可通过减轻细胞应激或提高HSP的表达起到减少细胞凋亡及保护细胞的作用，但尚未见其对角膜上皮创伤修复作用的报道。因此，全面深入的研究角膜上皮创伤修复机制，发现和探究更多促进角膜上皮创伤修复的物质和手段，造福患者将是我们所面临的重大课题之一。

［1］Vabulas R，Raychaudhuri S，Hayer-Hartl M，et al.Protein folding in the cytoplasm and the heat shock response［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2(12):a004390.

［2］Bruey J，Ducasse C，Bonniaud P，et al.Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c［J］.Nat Cell Biol，2000，2(9):645-652.

［3］Pandey P，Saleh A，Nakazawa A，et al.Negative regulation of cytochrome c-mediated oligomerization of apaf-1 and activation of procaspase-9 by heat shock protein 90［J］.EMBO J，2000，19(16):4310-4322.

［4］Xanthoudakis S，Roy S，Rasper D，et al.Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis［J］.EMBO J，1999，18(8):2049-2056.

［5］Guisbert E，Yura T，Rhodius VA，et al.Convergence of molecular，modeling，and systems approaches for an understanding of the escherichia coli heat shock response［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2008，72(3):545-554.

［6］Tsan M，Gao B.Heat shock proteins and immune system［J］.J Leukoc Biol，2009，85(6):905-910.

［7］Ono K，Han J.The p38 signal transduction pathway:activation and function［J］.Cell Signal，2000，12(1):1-13.

［8］Meng XZ，Ao LH，Song Y，et al.Post transcriptional regulation of ICAM-1 expression by p38 MAPK pathway in human microvascular endothelial cells:The role of HSP27［J］.Inflammation Res，2007，56(Suppl 2):S184.

［9］Chamcheu JC，Lorié EP，Akgul B，et al.Characterization of immortalized human epidermolysis bullosa simplex(KRT5)cell lines:trimethylamine N-oxide protects the keratin cytoskeleton against disruptive stress condition［J］.J Dermatol Sci，2009，53(3):198-206.

［10］Chamcheu JC，Pihl-Lundin I，Mouyobo CE，et al.Immortalized keratinocytes derived from patients with epidermolytic ichthyosis reproduce the disease phenotype:a useful in vitro model for testing new treatments［J］.Br J Dermatol，2011，164(2):263-272.

［11］Chamcheu JC，Navsaria H，Pihl-Lundin I，et al.Chemical chaperones protect epidermolysis bullosa simplex keratinocytes from heat stressinduced keratin aggregation:involvement of heat shock proteins and MAP kinases［J］.J Invest Dermatol，2011，131(8):1684-1691.

［12］Suaud L，Miller K，Panichelli AE，et al.4-Phenylbutyrate stimulates Hsp70 expression through the Elp2 component of elongator and STAT-3 in cystic fibrosis epithelial cells［J］.J Biol Chem，2011，286(52):45083-45092.

［13］Ma L，Liu Y，El-Achkar TM，et al.Molecular and cellular effects of Tamm-Horsfall protein mutations and their rescue by chemical chaperones［J］.J Biol Chem，2012，287(2):1290-1305.

［14］Yam GH，Gaplovska-Kysela K，Zuber C，et al.Sodium 4-phenylbutyrate acts as a chemical chaperone on misfolded myocilin to rescue cells from endoplasmic reticulum stressand apoptosis［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(4):1683-1690.

［15］Jia LY，Sun L，Fan DS，et al.Effect of topical ginkgo biloba extract on steroid-induced changes in the trabecularmeshwork and intraocular pressure［J］.Arch Ophthalmol，2008，126(12):1700-1706.

［16］Gong B，Zhang L，Pang C，et al.Trimethylamine N-oxide alleviates the severe aggregation and ER stress caused by G98R alphaA-crystallin［J］.Mol Vis，2009，19(15):2829-2840.

［17］Gong B，Zhang L，Lam D，et al.Sodium 4-phenylbutyrate ameliorates the effects of cataract-causing mutant gammaD-crystallin in cultured cells［J］.Mol Vis，2010，4(16):997-1003.

［18］Oberringer M，Baum HP，Jung V，et al.Differential expression of heat shock protein 70 in well healing and chronic human wound tissue［J］.Biochem Biophys Res Commun，1995，214(3):1009-1014.

［19］Zhou L，Yue BY，Twining SS，et al.Expression of wound healing and stress-related proteins in keratoconus corneas［J］.Curr Eye Res，1996，15(11):1124-1131.

［20］Miyamoto T，Saika S，Yamanaka A，et al.Wound healing in rabbit corneas after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis［J］.J Cataract Refract Surg，2003，29(1):153-158.

［21］Kim JM，Kim JC，Park WC，et al.Effect of thermal preconditioning before excimer laser photoablation［J］.J Korean Med Sci，2004，19(3):437-446.

［22］Shi B，Isseroff RR.Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein(HSP27)［J］.J Cell Physiol，2006，206(2):301-308.

［23］Shi B，Han B，Schwab IR，et al.UVB irradiation-induced changes in the 27-kd heat shock protein(HSP27)in human corneal epithelial cells［J］.Cornea，2006，25(8):948-955.

［24］Jain S，De la Cruz J，Kang E，et al.Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing［J］.Cornea，2012，31(7):820-827.

［25］Kim YS，Han JA，Cheong TB，et al.Protective effect of heat shock protein 70 against oxidative stresses in human corneal fibroblasts［J］.J Korean Med Sci，2004，19(4):591-597.

［26］Ishihara M，Sato M，Sato S，et al.Assessment of expressions of heat shock protein(HSP 72)and apoptosis after ArF excimer laser ablation of the cornea［J］.J Biomed Opt，2004，9(1):187-192.

［27］Ko JA，Yanai R，Quan WY，et al.Up-regulation of HSP70 by the fibronectin-derived peptide PHSRN in human corneal epithelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，370(3):424-428.

［28］Mushtaq S，Naqvi ZA，Siddiqui AA，et al.Changes in albumin precursor and heat shock protein 70 expression and their potential role in response to corneal epithelial wound repair［J］.Proteomics，2007，7(3):463-468.

［29］Mushtaq S，Naqvi ZA，Siddiqui AA，et al.Albumin precursor and Hsp70 modulate corneal wound healing in an organ culture model［J］.Acta Histochem，2011，113(1):36-42.

［30］孙景岗，张杰.大鼠角膜创伤愈合过程中HSP70表达的实验研究［J］.潍坊医学院学报，2011，33(3):205-208.

［31］Ma DH，Lai JY，Yu ST，et al.Up-regulation of heat shock protein 70-1(Hsp70-1)in human limbo-corneal epithelial cells cultivated on amniotic membrane:a proteomic study［J］.J Cell Physiol，2012，227(5):2030-2039.

［32］Ebrahimi M，Mohammadi P，Daryadel A，et al.Assessment of heat shock protein(HSP60，HSP72，HSP90，and HSC70)expression in cultured limbal stem cells following air lifting［J］.Mol Vis，2010，18(16):1680-1688.