FOXO3a基因在癌症中的研究进展

钟 振， 刘益飞， 刘俊华

现代医学认识到癌症是一种基因病，当调控细胞生长的基因发生突变或缺失时，会使得细胞持续生长及分裂而失去控制。一般而言，突变发生在调控细胞生长的重要基因上才有可能使正常细胞转化成癌细胞。抑癌基因产生的蛋白质的主要功能在于抑制细胞成长、调控有丝分裂和细胞复制。FOXO3a转录因子与细胞增殖、分化、肿瘤的发生发展及其血管生成等有重要关系［1］，其表达水平增高可促进肿瘤细胞的凋亡，具有抑制肿瘤细胞增殖的能力［2］。

1 FOXO3a的结构与功能

Forkhead转录因子是2000年才正式命名的一个新的转录因子家族，该家族的共同特征是具有一个保守的 DNA结构域，即Fox结构域(Forkhead box)，该结构域由100个氨基酸残基组成特征性3个α螺旋、3个β链及环1与C末端形成的翼状结构［3-5］。Fox家族包括100多个成员，分为A～Q 17个亚族，功能多样［6］。其中研究最深入的是O亚家族(FOXO)，主要在调控细胞增殖、分化、新陈代谢、凋亡以及调节免疫等方面起重要作用［7-8］。目前已知哺乳动物中 FOXO家族有4个成员，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4 和 FOXO6，分别由不同的基因编码，并定位于不同的染色体上［9-10］，其中研究最多的为 FOXO3a。FOXO3a定位于6号染色体(6q21)，编码673个氨基酸。其结构中的C末端作为核定位信号(nuclear localization signal，NSL)，对其功能至关重要，缺失则其几乎不能结合DNA从而影响转录功能。FOXO3a在人体内分布广泛，如胃肠、肝、肺、乳腺、卵巢、前列腺、外周血白细胞等。在人类，首次发现FOXO家族是其参与了肿瘤的染色体易位。进一步的研究发现FOXO作为转录因子，其活性高低、亚细胞定位以及参与的信号通路均与肿瘤的发生密切相关。FOXO3a的活性在多种水平上受到调节，包括基因表达水平、翻译后修饰、蛋白质的稳定性及蛋白质－蛋白质相互作用等多个层次。其中主要表现在对其磷酸化、乙酰化、亚细胞定位及降解的调节上［11］。FOXO3a转录因子是胰岛素/磷酸肌醇-3激酶(insulin-PI3K-AKt)信号通路中的重要信号分子，此通路对FOXO3a的表达有一定的负性调控作用。而在肿瘤中已经普遍发现PI3KAkt信号通路被激活。FOXO3a靶基因主要有:凋亡前基因Bim和p27Kip1非特异性周期依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)。在胰岛素样生长因子的诱导下，PI3K/Akt通路被激活，Akt使FOXO3a的3个关键磷酸化位点(Thr32，Ser253，Ser315)发生磷酸化，磷酸化的 FOXO3a与DNA亲和力下降，与14-3-3蛋白结合亲和力增强，并从细胞核转运至细胞质，Brunet等［12］认为14-3-3蛋白在胞核中与FOXO3a蛋白结合，可能通过诱导FOXO3a分子的构象发生改变，暴露出核输出序列并与核外运蛋白(exportin)CRM1相互作用，从而促进FOXO3a蛋白的核输出;在细胞质中14-3-3蛋白与FOXO3a蛋白结合，使FOXO3a蛋白滞留在细胞质内，从而抑制其活性［13-15］。除Akt外，还有其他激酶也可磷酸化 FOXO蛋白。研究表明 SGK，IκB(IKK)，CK1，DYRK1a和 Ras-Ral信号通路都可磷酸化FOXO的不同位点。现已发现在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌中均存在FOXO3a磷酸化及其胞核输出。因此，考虑其在细胞凋亡和肿瘤发生中所起到的重要作用，由不同机制导致的FOXO3a失活可能会促进肿瘤的发生。

2 FOXO3a与各肿瘤的关系

2.1 FOXO3a与乳腺癌的关系 目前的研究证实FOXO3a表达水平异常与乳腺癌的发生关系密切。FOXO3a的活性表现为上调Bim基因和p27Kip1基因［16］抑制细胞周期。另外，大约70%的人类乳腺癌表达雌激素受体［17］。研究证明雌激素受体(ER)在乳腺癌的发展和治疗效果上扮演重要的角色。ER阳性则提示预后良好，且作为内分泌治疗的指征［18］。FOXO3a调节ER的功能以利于乳腺癌的治疗。Zou等［19］通过向无胸腺的老鼠体内注射过表达FOXO3a的雌激素依赖乳腺癌细胞株MCF-7细胞系，利用免疫组化和免疫印迹技术分析结果表明:在ER阳性的MCF-7细胞中，FOXO3a的表达降低了ER调节基因，这些基因在细胞增殖中有重要作用。同时他们发现FOXO3a可上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p21Cip1，p27Kip1和p57Kip2抑制癌细胞增殖;相反，敲除FOXO3a基因却促进了肿瘤细胞的生长。Sunters等［20］研究发现，利用紫杉醇处理乳腺癌MCF7细胞株后，FOXO3a及其靶基因Bim和p27Kip1表达水平显著升高。而通过小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)抑制 FOXO3a后，FOXO3a、Bim和p27Kip1的表达水平降低，从而降低了药物诱导的细胞凋亡。此外，FOXO3a的亚细胞定位与肿瘤生长密切相关，Habashy等［21］发现定位于细胞核的FOXO3a可以介导CDK等细胞周期抑制因子的表达，而PI3K/AKt通路通过磷酸化FOXO3a阻碍其在细胞核中表达使预后不良。因此，FOXO3a的表达水平、磷酸化水平及亚细胞定位与乳腺癌的发生发展以及预后都有着紧密联系。

2.2 FOXO3a与卵巢癌的关系 卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤，其发生涉及多种分子事件。筛选有效的治疗靶点已成为卵巢癌治疗的研究热点之一。目前人们初步认识到FOXO3a作为转录因子参与卵巢癌的发生发展。Fei等［22］的研究结果表明在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和恶性卵巢肿瘤中FOXO3a的表达水平依次降低。同时分析了FOXO3a和P27kip1表达相关性，表明二者均为阳性表型的卵巢癌患者总体生存率显著高于其他表型的患者。Lu等［23］进一步证明FOXO3a低表达与卵巢癌的预后不良显著相关。他们将46例临床病理确诊的卵巢癌样本分为FOXO3a高表达和低表达两组，并分析其表达水平与预后的关系，结果表明FOXO3a的表达与肿瘤分期和淋巴结转移有关，而与肿瘤转移和肿瘤大小等预后因素关系不大。高表达组死亡率(29.63%)较低表达组(57.89%)有显著差异。他们还注意到FOXO3a磷酸化表型的患者预后较差［24］。这可能是由于磷酸化FOXO3a定位于细胞质而失去活性所致。因此，FOXO3a有望成为卵巢癌的一个潜在的预后指标。

2.3 FOXO3a与白血病的关系 FOXO3a是哺乳动物FOXO基因家族在淋巴细胞中表达的主要亚型。在人原代造血原细胞、UT-7/EPO白血病细胞、Ba/F3原B细胞系中高表达的FOXO3a能够诱导细胞发生凋亡［25］。近年来的研究证实FOXO3a的磷酸化主要受PI3K/AKt信号通路的调节，而在血液学恶性肿瘤中可观察到AKt普遍异常活化。目前已经观察到在慢性粒细胞白血病、急性骨髓性白血病和多发性骨髓瘤中有FOXO3a的磷酸化失活现象。这些发现表明，磷酸化FOXO3a参与白血病和多发性骨髓瘤的病理生理发展。Sakoe等［26］在研究中发现使用全反式维甲酸(ATRA)在治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)时，FOXO3a在调节粒细胞变异和调亡中起到关键性的作用。他们使ATRA同时作用于粒细胞衍生的NB4细胞和ATRA抵抗的NB4/RA细胞。发现在ATRA作用于NB4细胞24～48小时后FOXO3a磷酸化水平明显下降，同时AKT的磷酸化亦显著降低，而在NB4/RA细胞中未观察到，由此推测ATRA可通过抑制AKt活性来使FOXO3a脱磷酸化。通过显微共焦技术分析发现在ATRA作用之前FOXO3a主要定位于细胞质，在ATRA作用48小时后其定位于胞核中。此外，还发现用ATRA治疗后的NB4细胞分化为成熟粒细胞的能力与FOXO3a的表达水平有关。完全敲除FOXO3a基因后细胞周期明显受影响。Kornblan等［27］运用反相蛋白组数法分析了511例新近诊断的白血病样本中FOXO3a总蛋白和磷酸化表达水平，发现FOXO3a磷酸化比率越高的患者更可能具有原始耐药性和较短的缓解期。他们推测当FOXO3a磷酸化受抑制时经治疗残余的原始粒细胞加速增殖，导致耐药性的发生并使缓解期缩短。而当脱磷酸化的FOXO3a水平升高时，可维持原始细胞的休眠状态，抑制其增殖。因此，磷酸化的FOXO3a对于白血病来说是一个不利的预后因子。如何控制FOXO3a的亚细胞定位以及脱磷酸化从而恢复其功能就成为白血病治疗的研究重点［28］。

此外，FOXO3a 在胃肠道肿瘤［29］，肺癌［30-31］，前列腺癌等的研究还尚处于初步阶段。近年来，基因靶向治疗日益受到重视。基于FOXO3a在细胞凋亡与肿瘤发生中的重要作用，因此，被看作是癌症诊断和治疗的新靶点。如何研究和开发有效的药物调节其活性，从而抑制肿瘤的发生、发展，提高患者的生存质量及改善预后，还需要更进一步的研究和探索。

［1］ Potente M，Urbich C，Sasaki K，et al.Involvement of FOXO Transcription factors in angiogenesis and postnatal neovascularization［J］.J Clin Invest，2005，115(9):2382-2392.

［2］ Gree EL，Brunet A.FOXO transcription factors at the interface between longevity and tumor suppression［J］.Oncogene，2005，24(50):7410-7425.

［3］ Tsai KL，Huang CY，Chang CH，et al.Crystal structure of the human FOXK1a-DNA complex and its implications on the diverse binding specificity of winged helix/forkhead proteins［J］.Biol Chem，2006，281(25):17400-17409.

［4］ Stroud JC，Wu YM，Bates DL，et al.Structure of the forkhead domain of FOXP2 bound to DNA［J］.Structure，2006，14(1):159-166.

［5］ Weigelt J，Climent I，Dahlman-Wright K，et al.Solution structure of the DNA binding domain of the human forkhead transcription factor AFX(FOXO4) ［J］.Biochem，2001，40(20):5861-5869.

［6］ Jonsson H，Peng SL.Forkhead transcription factors in immunology［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62(4):397-409.

［7］ Kaestner KH，Knochel W，Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors［J］.Genes Dev，2000，14(2):142-146.

［8］ Arden KC，Biggs WH 3rd.Regulation of the FoxO family of transcription factors by phosphatidylinositol-3 kinase-activated signaling［J］.Arch Biochem Biophys，2002，403(2):292-298.

［9］ Brikenkamp KU，Coffer PJ.FOXO transcription factors as regulators of immune homeostasis:molecules to die for［J］.J Immunol，2003，171(4):1623-1629.

［10］ Junger MA，Rintelen F，Stocker H，et al.The Drosophila forkhead transcription factor FOXO mediates the reduction in cell number associated with reduced insulin signaling［J］.J Biol，2003，2(3):20.

［11］ Vogt PK，Jiang H，Aoki M.Triple layer control:phosphorylation，acetylation and ubiquitination of FOXO proteins［J］.Cell Cycle，2005，4(7):908-913.

［12］ Brunet A，Kanai F，Stehn J，et al.14-3-3 transits to the nucleus and participates in dynamic nucleocytoplasmic transport［J］.J Cell Biol，2002，156(5):817-828.

［13］ So CW，Cleary ML.Common mechanism for oncogenic activation of MLL by forkhead family proteins［J］.Blood，2003，101(2):633-639.

［14］ Dansen TB，Smits LM，Vantriest MH，et al.Redox sensitive cysteines bridge p300/CBP-mediated acetylation and FoxO4 activity［J］.Nat Chem Biol，2009，5(9):664-672.

［15］ Huang H，Regan KM，Wang F，et al.Skp2 inhibits FOXO1 in tumor suppression through ubiquit in mediated degradation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(5):1649-1654.

［16］ Accili D，Arden KC.FoxOs at the crossroads of cellular metabolism，differentiation，and transformation［J］.Cell，2004，117(4):421-442.

［17］ Johnston SR，Dowsett M.Aromatase inhibitors for breast cancer:lessons from the laboratory［J］.Nat Rev Cancer，2003，3(11):821-831.

［18］ Murphy LC，Watson P.Steroid receptors in human breast tumorigenesis and breast cancer progression ［J］.Biomedicine Pharmacotherapy，2002，56(2):65-77.

［19］ Zou Y，Tsai WB，Cheng CJ，et al.Forkhead box transcription factor FOXO3a suppresses estrogen-dependent breast cancer cell proliferation and tumorigenesis［J］.Breast Cancer Res，2008，10(1):R21.

［20］ Sunters A，Madureira PA，Pomeranz KM，et al.Paclitaxel induced nuclear translocation of FOXO3a in breast cancer cells is mediated by c-Jun NH2-terminal kinase and Akt［J］.Cancer Res，2006，66(1):212-220.

［21］ Habashy HO，Rakha EA，Aleskandarany M，et al.FOXO3a nuclear localisation is associated with good prognosis in luminal-like breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，129(1):11-21.

［22］ Fei M，Zhao Y，Wang Y，et al.Low expression of Foxo3a is associated with poor prognosis in ovarian cancer patients［J］.Cancer Invest，2009，27(1):52-59.

［23］ Lu M，Zhao Y，Xu F，et al.The expression and prognosis of FOXO3a and Skp2 in human ovarian cancer［J］.Med Oncol，2012，29(5):3409-3415.

［24］ Lu M，Xiang J，Xu F，et al.The expression and significance of pThr32-FOXO3a in human ovarian cancer［J］.Med Oncol，2012，29(2):1258-1264.

［25］ Asselin-Labat ML，David M，Biola-Vidamment A，et al.GILZ，a new target for the transcription factor FoxO3，protects T lymphocytes from Interleukin-2 withdrawal-induced apoptosis［J］.Blood，2004，104(1):215-223.

［26］ Sakoe Y，Sakoe K，Kirito K，et al.FOXO3A as a key molecule for all-trans retinoic acid-induced granulocytic differentiation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia ［J］.Blood，2010，115(18):3787-3795.

［27］ Kornblau SM，Singh N，Qiu Y，et al.Highly Phosphorylated FOXO3A Is an Adverse Prognostic Factor in Acute Myeloid Leukemia［J］.Clin Cancer Res，2010，16(6):1865-1874.

［28］ Yang JY，Hung MC.A new fork for clinical application:targe-ting forkhead transcription factors in cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15(3):752-757.

［29］ 谭小平，张庆，朱燕妮，等.Foxo3a对胃癌细胞SGC7901凋亡的促进作用［J］.世界华人消化杂志，2009，17(30):3092-3095.

［30］ Herzog CR，Blake DC Jr，Mikse OR，et al.FoxO3a gene is a target of deletion in mouse lung adenocarcinoma［J］.Oncol Rep，2009，22(4):837-843.

［31］ Blake DC Jr，Mikse OR，Freeman WM，et al.FOXO3a elicits a pro-apoptotic transcription program and cellular response to human lung carcinogen nicotine-derived nitrosaminoketone(NNK)［J］.Lung Cancer，2010，67(1):37-47.