组织工程血管化策略的研究进展

王宇翀 综述 薛春雨 审校

组织工程的目的是构建具有正常生理功能的组织和器官，用于修复人体的疾病和缺损[1]，目前已经取得了一定的突破[2]。体外构建的组织工程化产品中，已有皮肤[3]、软骨和骨[4]应用于临床。但是，体外构建的组织工程化组织缺乏与之相适应的血液供应系统[5]，是目前组织工程面临的难点。

现在，组织工程血管化主要有两类策略。第一类是基于内皮细胞等构建新的血管，在这个过程中生长因子也有促进新生血管的作用。第二类是基于支架技术，包括天然生物衍生的支架和人工合成支架。以上两种策略没有明显界限，而是相互重叠。

1 人体内的新生血管形成过程

人体内新生血管形成基于两种过程：血管生成（Angiogenesis）与血管形成（Vasculogenesis）。血管生成是原先存在的血管以出芽的方式生成新的毛细血管。血管形成是内皮细胞重组后形成毛细血管，并与原有血管网对接的过程。最初，内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）分化为成熟的内皮细胞，这些细胞在无血管的区域增殖并且创造了第一个初始的血管网络[6]。然后，新的毛细血管从原先存在的血管生出，内皮细胞释放基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）降解细胞外基质，细胞迁移到新的间隙，出芽形成新的血管。这个过程由多种类型的细胞、黏附蛋白、生长因子、连接分子、内源性抑制剂等共同参与和相互作用而产生[7]。

形成所需生理功能的血管不仅需要时间顺序上的精确调节，也需要在血管成熟后抑制内皮细胞的过度生长，从而抑制过多的营养和氧气供应到组织。相反，血管延迟成熟会抑制血液循环或导致血管退化，甚至造成血管穿孔、缺失[8]。

对于缺血组织再灌注或诱导组织工程血管产生，上述过程是必不可少的。事实证明，缺血组织新血管生成恢复再灌注已经实现，然而组织工程产物血管化问题尚未解决。

2 组织工程诱导血管生成的策略

2.1 基于内皮细胞等构建血管

机体内所有的血管内壁都是由内皮细胞组成的，大的血管外层有平滑肌细胞包裹，而毛细血管主要是由血管内皮细胞组成。血管内皮细胞的作用主要有抗凝、选择透过性、调剂血压和血管生成的作用[9]。

支架上的细胞得以成活，需要通过扩散或灌注得到足够的营养和氧气。然而，毛细管扩散的最大距离在100～200 μm[10]。研究表明，只有皮肤、软骨和骨组织可以接受更远的血管通过扩散所提供的氧气和营养，所以目前只有组织工程皮肤、软骨和骨应用于临床。因此，体外较厚组织的血管化构建和体内血管的连接，是组织工程化组织构建成功的必要条件之一。

在体外，通常把内皮细胞、成纤维细胞等单独或混合接种于支架，以构建三维血管化的结构。随后将构建的血管网络植入缺血区，建立一个由周围血管提供血液的组织，这一过程称为吻合[11]。体外预血管化的优点是宿主血管不需要长入工程化组织中间，而可以吻合边缘的血管结构。缺点是灌注慢于体内的血管化。许多研究已证明，宿主细胞能够在适当的人工结构中建立一个可灌注的血管网络[12]，经过成功的血管化后，可以取出并用于插入缺血性靶位点。这一方法的缺点是需要至少三次手术：植入无细胞支架、取出血管化支架和植入缺血区[13]。

2.2 生长因子及细胞因子促进血管化

生长因子及细胞因子对血管化过程具有重要的促进作用，可有效刺激内皮细胞和祖细胞的聚集与增殖，促进新生血管形成及发育成熟。目前已知的促进血管生成的因子主要有 VEGF、bFGF、HGF 等；另外一些细胞因子，如 PDGF、TGF-β、Ang等，作为间接的血管生成因素参与内皮细胞的再生，加速血管化的进程。

为使生长因子效能最大化，往往需先解决一些问题。例如，血管生成因子在体内具有高度不稳定性，因此多采用局部注射和控释等手段[14]。为了克服生长因子的高降解率，找到可随时间变化释放生长因子至目标植入部位的生物材料，确保生长因子的有效传递和持续发挥作用，目前合成了各种复合材料的缓释装置[15]。可降解多孔层结构或预包埋的微球生物材料已用于控制生长因子的释放，把生长因子包埋在生物可降解的聚合物中，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或多聚赖氨酸（PLL）[16]，这样生长因子可以持续释放。离子白蛋白微球技术则可以同时控制两种生长因子释放。

另一种方法是使用转染的细胞过度表达生长因子。一旦种子细胞种植在支架上，这些细胞就可以持续释放生长因子。Geiger等[17]将涂有VEGF质粒DNA的BMSCs支架和接种转染VEGF质粒DNA的BMSCs支架进行比较，结果发现两组的血管生成和骨生成都显著增强，其中后者的血管再生更快，骨支架吸收的速度也更快。同样，心肌梗死后使用VEGF基因转染MSCs可促进心肌血管的生成，改善心肌的灌注。

生长因子的剂量和组合方式也是血管生成与否的关键因素。例如，高水平的PDGF会导致血管的不稳定[18]；通过Ang-1过度表达，来加强三维多孔藻酸盐支架的血管化，可能会导致血管内皮增生和血管丢失减少[19]。目前，大部分实验的重点仍然是研究一种类型的生长因子，而生长因子之间和多信号通路之间复杂的相互作用也应考虑。在新构建的水凝胶基质上，通过结合VEGF和Ang-1，或结合VEGF、IGF、SDF-1的组合，均取得良好效果[20]。

为了避免生长因子在靶点以外的部位产生不良影响，许多研究也致力于生长因子作用部位的固定[21]。Saik等[22]通过共价固定PDGF-BB在聚乙二醇水凝胶中来促进血管生成。除此之外，特定的黏附肽或细胞外基质分子修饰生物材料也可用来促进血管生成。

2.3 血管化支架

组织工程中血管化和支架材料的特性有很大的关系。除了在储存和释放功能性化合物和为所有参与其中的细胞提供合适的表面类型外，支架本身就能够促进血管的形成。人工构建细胞外基质的三维支架结构，不但为内皮细胞等的生长提供了一个有利的空间，也为植入的细胞分泌细胞外基质并最终形成相应的组织或器官提供了一个良好的环境。血管化支架可分为天然生物衍生的血管支架和人工合成的血管支架两大类。

2.3.1 天然生物衍生的血管支架

目前在体外模仿天然血管结构和重建微血管网络仍具有很大的挑战性，生物结构的重新利用可能是解决该问题的方法[23]。通过部分脱细胞基质可以得到一个自然衍生的三维微血管网络，脱细胞基质的制作过程揭示了动脉和静脉穿过胶原蛋白和弹性蛋白纤维基质的特点[24]。血管化的生物基质用于组织工程可提供适当的营养，确保了更好的移植效果[25]。天然生物衍生的血管支架的优点是：①材料的生物相容性较好；②可降解性好，且降解产物无毒副作用；③材料本身具有相同或类似的细胞外基质结构，可促进细胞黏附、增殖和分化。其缺点是：①制作过程难以规范化；②无法复制出完全相同的支架；③取材在伦理上仍有争议。

2.3.2 人工合成的血管支架

人工合成的血管支架从简单的支撑作用，到目前已扩展为可以提供机械稳定性、愈合能力与降解率相适应的综合性支架[26]。对于支架材料的选择要考虑到支架硬度、表面形态、结构特性、生物相容性、孔隙率（包括孔径和孔间距离）和降解特性等[27]。此外，巧妙的三维设计和高分辨率制造技术也可用来精确控制细胞排列和血管生成[28]。但是，目前尚未发现一种能同时满足上述条件的人工支架。人工合成的血管支架的优点是：①可选择多样的材料与先进的制造技术；②可以大批量标准化生产；③根据实际需要可进行多样化设计。其缺点是：①空间结构复杂的几何形状制作难度大；②缺乏必要的生物功能；③细胞黏附力差。

3 存在的问题与展望

组织工程显示出诱人的前景和巨大的可能，而组织工程血管化仍然是组织工程中的关键问题。既往的研究发现了许多促进血管化的方法，有了一些新的见解和进展，但同样存在许多亟待解决的问题，比如进一步阐释血管化的具体机制、合理高效利用生长因子、发现新的支架材料，以及各种因子与材料潜在的风险等。应将不同的方法、技术和学科结合在一起，研究更加高效简便的组织工程血管化方法，为构建组织工程化组织并应用于临床奠定基础。

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