表皮干细胞的研究进展

周树萍 宗宪磊 综述 牛扶幼 刘林嶓 蔡景龙 审校

皮肤是人体最大的器官，也是人体的第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下组织及其附属器组成。皮肤具有保持自身结构和正常生理状态稳定的能力。研究表明，皮肤更新的动态平衡是由表皮干细胞（Epidermal stem cells，ESCs）增殖和分化之间的平衡决定的。ESCs是各种表皮细胞的祖细胞，是皮肤不断自我更新的源泉。近年来，ESCs的研究取得了积极进展，本文就ESCs定位、标记物、特性、调节机制及其应用前景等研究现状及进展进行综述。

1 定位研究

ESCs并非随机地分布于皮肤组织中，而是有着与它自己本身结构和功能相关联的空间布局模式。一是表皮增殖单位，即表皮细胞呈相互独立的垂直六角形的微细组织单位，每单位由居于其基底层中心的一个表皮干细胞、基底层上层的八到十个短暂扩充细胞及最上层的多个定向细胞或终末分化细胞组成；二是网状峪模式，即通常认为的表皮干细胞位于表皮的基底层。

2006年，Moore等[1]发现，ESCs来源于胚胎的外胚层，是皮肤组织中的专能干细胞，是一种成年组织干细胞，具有增殖并分化成表皮中各种细胞维持皮肤正常表皮结构，及在一定诱导条件下表现出胚胎干细胞性能的双向分化能力，是一种潜在的多能干细胞。2008年，王联群等[2]通过对Ⅳ胶原快速分选的ESCs进行免疫荧光检测，观察到ESCs位于表皮基底层，均表达β1整合素、角蛋白19和P63，且随着年龄不同其含量和分布有所差别，如β1整合素、角蛋白19和P63在胎儿表皮基底层细胞中均呈强阳性表达，在少儿表皮基底层细胞中大部分表达且阳性细胞均匀分布，而在成人表皮基底层细胞中则呈弱阳性表达且阳性细胞散在分布。2012年，Dahl等[3]发现，成人ESCs主要位于表皮细胞龛、皮脂腺和毛囊的隆突区域，这些ESCs能够发育成表皮的各种细胞，更新死亡的表皮、皮脂腺和毛囊，其中，毛囊干细胞是ESCs的主要来源，毛囊隆突部是ESCs的主要分布部位，对毛囊的生长和新陈代谢，对表皮损伤后的修复均具有重要的作用。

研究表明，不同部位的ESCs功能是不同的。Jensen等[4]研究发现，在小鼠皮脂腺至毛囊间的区域存在一群LRIG1（抑癌基因）阳性的细胞，这些细胞在裸鼠皮肤重建过程中，不仅能发育成毛囊和皮脂腺，还能发育成表皮。Plikus等[5]发现，毛囊部存在ESCs，且在毛囊隆突部区域的ESCs负责补充毛发再生，而在毛囊峡部的ESCs（漏斗部和毛囊之间的交界处）主要负责表皮和皮脂腺的再生。

2 标志物研究

ESCs可通过表面标志物进行鉴定，目前用于ESCs分离鉴定的表面标志物众多。Eckert等[6]报道利用鉴定干细胞的标记物，能够鉴定干细胞在表皮内的特殊区域，了解这些细胞在正常表皮的内环境稳定和组织应激条件中的作用。

研究表明，目前ESCs的分选方法主要为，一是根据细胞表面标记物表达分选，采用流式细胞仪鉴定分选细胞表面的干细胞标记物，包括整合素 α6、整合素 β1、CD71、CD49、CD34、CD 133、P63[7-9]；二是通过角质干细胞对细胞外基质的差速黏附进行分选；三是密度梯度离心法。

在ESCs研究中，目前应用最多的表面标志物主要有整合素β1、角蛋白19、核蛋白P63等[2]，其他标记物还有 CD71、PCNA、Oct4、Nanog、C8/114B 以及 CD34 等[10]。

赖麒等[11]通过激光共聚焦显微镜，将组织切片进行1 μm厚的断层扫描，发现在ESCs和短暂扩增的细胞表面整合素β1呈现高表达状态，而在终末分化细胞表面整合素β1不表达，认为整合素β1是区分ESCs与短暂扩增细胞及终末分化细胞的主要表面标志物。

Inoue等[12]通过免疫组化及流式细胞分选等技术，发现细胞角蛋白 19（CK19）和细胞角蛋白 15（CK15）是 ESCs的阳性标志物。Inoue等在研究干细胞的分化过程中，发现CK15表达的减少较CK19表达的减少更早，认为CK15阴性而CK19阳性的细胞可能是“早期”短暂增殖细胞，因此认为CK15在鉴别毛囊隆突部ESCs方面可能比CK19更有意义。2012年Nanashima等[13]认为毛囊干细胞标志物是CK15和CD34，未分化角质化细胞的标志物是CK5。

Oster[14]认为，p63是具有调节并放大细胞增殖分化信号作用的一种蛋白质，在ESCs生物性能的维持和增殖分化方面起着决定性作用。Choi等[15]在研究透明质酸寡糖增加表皮细胞干细胞特性的作用时发现，p63基因的表达也增加了，间接表明p63是ESCs的标志物之一。

Oct4基因是POU转录因子家族的一员，主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中，对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新功能具有极其重要的作用，因此对于来源于胚胎干细胞的ESCs，Oct基因在其保持多潜能性和自我更新中起着同样重要的作用。Zhang等[16]在研究Wnt/β-catenin信号在体内外对表皮细胞去分化的作用时发现，在活化剂诱导下Oct4的表达增高，细胞呈现干细胞特性。

Nanog基因是近年来在胚胎干细胞（ES细胞）内发现的一个重要转录因子，该因子对维持ES细胞的自我更新起着关键作用，不仅能够促进ES细胞的自我更新，保持ES细胞的未分化特性，而且能够使终末分化细胞进行增殖活动[17-18]。研究表明，在ESCs中Nanog基因的表达呈现阳性，因此可以通过检测Nanog的活性及含量来检测ESCs。

3 特性研究

ESCs属于未分化细胞，具有未分化细胞的特性，表现为细胞体积小，细胞核大而胞浆少，核浆比例大，细胞内RNA含量低，细胞器较少且不成熟，在组织结构中位置相对固定。此外，它还具有三个典型的基本特性，即自我更新能力、慢周期性和黏附特性。

ESCs具备自我更新能力，通过有丝分裂，增殖产生新的ESCs和分化产生子代角质细胞，参与皮肤代谢，产生新的表皮[19]。ESCs这种自我更新与分化潜能是其维持着整个表皮组织的稳态。ESCs能够进行均衡的无分化和有分化的分裂，ESCs的增殖和分化之间的平衡维持着皮肤内环境的稳定。

研究表明，ESCs存在静止期和活化期两种细胞[20]，成体ESCs和毛囊干细胞会出现均衡的或单向的命运：①分化，最终从组织中消失；②均衡更新，自我更新。Oshimori等[21]研究认为，休眠的ESCs和下面的间质真皮乳头之间传递信息，产生充足的激活信号，超过抑制性的BMP信号，毛囊再生开始，ESCs在毛发生长和皮肤创伤后被活化和迁移；Frances等[22]研究证实毛囊间ESCs和皮脂腺前体细胞是两种具有单一分化潜能的干细胞，分别维持它们各自的组织稳态。

离体培养时，ESCs呈克隆性生长，如进行连续传代培养，ESCs可进行140次分裂，即能产生1×1040个子代细胞，这一特性对维持表皮的再生和长期动态平衡具有重要意义。Zhang等[23]报道，从小鼠触须部毛囊的隆突部取得一个毛囊干细胞，通过单克隆培养后得到了足够数量的毛囊干细胞，并移植到了裸鼠背部，发育成了新的毛囊。

ESCs具有慢周期性（Slow cycling），即ESCs在体内表现为标记滞留细胞（Label-retaining cell），如在新生动物细胞分裂活跃时加入氚标的胸苷，由于ESCs分裂缓慢，因而可长期探测到放射活性，以保证其巨大的增殖潜能。Fuchs等[24]在干细胞的慢周期性的研究中，研究了毛囊干细胞在增殖与分化之间的平衡关系，发现毛囊干细胞具有慢周期性，同时是降低DNA复制时出错几率的关键。

ESCs的另一个显著特点是对基底膜的黏附。研究表明，ESCs主要通过表达整合素（Integrins）实现其对基底膜各种成分的黏附功能。干细胞对基底膜的黏附是干细胞维持其特性的基本条件，干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群落，进入分化周期的重要调控机制之一。

4 调节机制研究

干细胞具有多向分化潜能，周边微环境对其增殖、分化有重要调节作用。细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间及各种细胞因子均构成对干细胞分化的调控，其调节机制相当复杂，一直是研究的重点和需要解决的难题。ESCs的分化增殖调节机制也是如此，目前的研究还在初步阶段。

微环境，包括外在因素、生长因子、细胞外基质和细胞间通信等，对于细胞命运有重要影响。受到外部信号的影响，角质化细胞协同其他种类的细胞调节创面愈合过程中的创面微环境。Lin等[25]的研究表明，TGF-β信号通路在毛囊中不同干细胞群的增殖、分化和编程性细胞死亡中起到重要作用；Connelly[26]证实了ESCs与细胞外基质之间的相互作用具有调节 ESCs 的终末分化作用；Martínez-Martínez 等[27]的临床和实验研究显示，延迟愈合的创面感觉神经分布减少，认为感觉神经分布可能在创面愈合过程中对毛发干细胞的生理学起到功能性作用；Doles等[28]研究认为，老化对细胞因子和干细胞内环境稳定具有破坏作用，干细胞会随着老化而衰退，影响老年人的皮肤损伤修复；Li等[29]报道了ESCs向创面迁移在创面愈合过程中起到重要作用，内源性的电场出现于创面，ESCs表现出明显的趋电性，以调节创面愈合；赖麒等[11]综述近年来文献认为，ESCs的增殖分化受到壁龛及Wnt信号通路、MAPK、c-Myc、Notch信号传导通路、细胞因子等的调控；Firestone等[30]研究认为,要使干细胞按照需要分化为特定的细胞株，需要有选择地活化特定信号通路，使特定靶基因表达，并通过表观遗传机制维持相应的细胞表型状态。

近期研究发现，成人皮肤表皮中存在不连续的多个ESCs群，存在于皮肤的不同位置，称为细胞龛，能分化成不同的细胞谱系，维持着表皮不同部分的再生。但是，每个干细胞群在生理条件下的确切作用还不清楚，调控ESCs的增殖和分化的精确机制尚不清楚。研究表明，毛囊滤泡膨胀部的干细胞可短暂扩增表皮类的后代细胞，参与初期的再上皮化；位于毛囊峡部的干细胞群体，产生长效后代细胞，修复创面表皮，产生新的滤泡间ESCs；位于膨出部的干细胞补充毛囊谱系，位于峡部的干细胞再生滤泡间上皮和皮脂腺。近期研究显示，毛囊干细胞对皮脂腺谱系和染色体畸变具有重要作用、micro-RNAs(miRs)对ESCs更新和分化具有调整作用[31]，黑色素干细胞存在于毛囊的膨胀部，皮肤干细胞分化为有功能的表皮黑色素细胞，可以调整皮肤的色素含量[32]。总之，通过谱系研究可以了解干细胞分布及其后代，从而利于研究ESCs的生物学特性[33-35]。

近年来，一些动物模型系统的建立，例如人源化的小鼠或体外器官培养，促进了人皮肤维持和重建，以及表皮再生的研究。这些动物模型可用于谱系示踪实验，采用遗传学的方法改良细胞类型，进行人干细胞的研究，了解皮肤干细胞群的位置、微环境及其重要性，探讨干细胞的命运和再生潜能的关键调整因素[36]。

5 应用研究

付小兵等[37]提出了ESCs可成为实现创面由解剖修复到功能修复飞跃的新策略，经过十余年的研究更加证明了这一认识的重要性。ESCs具有多向分化潜能、自我更新能力和高度的增殖能力，在创面功能修复、皮肤组织工程、皮肤遗传病治疗等方面的作用日益显现。

研究创面愈合延迟和过度增生的机制及应对措施并用于临床，是转化医学的重要任务之一[38]。当皮肤受到损伤时，特别是大面积深度烧伤时，由于毛囊和汗腺等皮肤附属器严重受损而影响伤者的生活质量，近年来细胞生物学的发展为临床应用ESCs治疗大面积皮肤损伤带来了希望。如创面愈合的标志是创面的上皮化，ESCs在创面上皮化中具有重要作用，成为目前的研究热点。随着ESCs研究的深入，应用ESCs促进创面愈合、治疗增生性瘢痕以及瘢痕疙瘩有着广阔的应用前景[39]。Zhang等[23]报道即使是单个毛囊也能够提供研究所需的毛囊干细胞，来自于毛囊膨胀部的干细胞高表达基底层标志物CK14、整合素α6、P63和CK15，将其移植于裸鼠背部，长期体内培养，GFP标记的毛囊干细胞形成新的毛囊、表皮和皮脂腺，说明毛囊干细胞对治疗皮肤损伤和疾病有潜在的应用前景。Plikus等[35]研究发现一个ESCs池，提出了表皮再生医学，即当皮肤损伤时，位于表皮中的ESCs就会在内外因素的调控下，增殖分化成相关细胞，以修复机体损伤的表皮。Ghadially报道加快对ESCs的了解可能有助于改善患者的治疗[40]。但是，实现创伤无瘢痕愈合等问题仍需更深入的研究。

研究和制备出与皮肤结构和功能一致的皮肤替代物，一直是皮肤组织工程的研究方向，ESCs可作为皮肤组织工程的种子细胞，在皮肤组织工程研究中具有重要作用。董丽等[41]报道，采用以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架，与ESCs复合后制备的组织工程皮肤具有表皮和真皮双层结构，可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求；杨青等[42]通过对体外分离培养的ESCs和毛囊干细胞的生物学特性进行比较，发现二者均可作为皮肤组织工程的种子细胞，而毛囊干细胞较ESCs更具优势。

随着基因研究的深入，基因治疗的临床应用进入到一个新的阶段。ESCs的基因治疗包括导入标志性基因或一个异源基因，使细胞内原有基因过度表达，或诱导某个基因的突变等，可用于治疗皮肤基因性疾病。如交界型大疱性表皮松解症（JEB）是由于表皮基底膜内的层黏连蛋白5基因突变所致，Mavilio等[43]把表达层黏连蛋白 5β3(LAM5-bata3)的基因片段整合到病毒载体形成cDNA，再将其转移到LAM5-bata3缺陷的JEB患者的ESCs内并进行体外培养，然后再将这些培养传代的细胞移植到患者病变部位，1年随访发现移植部位皮肤完好，没有发生水疱、感染、炎症及免疫排斥反应，并且移植部位新生的表皮更新是由基因转染的干细胞维持的，这表明ESCs的基因治疗是可取的。

Su等[44]通过对敲除小鼠的p63基因研究发现，小鼠皮肤出现过早衰老、水疱、溃疡，因此可知ESCs通过调节细胞衰老和基因组的稳定性，从而防止过早的组织老化。

6 结语

ESCs是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，是皮肤及附属器发生、分化的摇篮。ESCs能主动参与创面修复，促进创面再上皮化，在很多皮肤性疾病的治疗、皮肤干细胞的组织工程学疗法、基因治疗中都有很好的应用前景。但是目前尚有许多问题亟待解决，如定义干细胞的分子标记物、祖细胞亚群的分子标记物，确定干细胞的位置、不同谱系干细胞的环境对ESCs增殖和分化的调节通路等方面[41]，应进一步加快对ESCs的研究，使得ESCs更好地应用于临床。

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