Vip3A杀虫蛋白随机重组文库的构建与分析

张宁 刘荣梅 束长龙 张杰 李海涛 高继国

（1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）为革兰氏阳性菌，Bt在芽胞的形成过程中能够产生杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），这种伴胞晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等多种重要的害虫都有特异性的毒杀作用。1996年，Estruch等［1］在Bt发酵上清液中发现了营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs）。VIPs与Bt在芽胞形成的过程中产生的杀虫晶体蛋白的同源性极低。VIPs分为Vip1、Vip2、Vip3和Vip4，其中尤其Vip3A 蛋白对鳞翅目夜蛾科害虫（如小地老虎、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫等）具有广谱高效的杀虫活性［2］。其中Vip3Aa蛋白间的氨基酸序列同源性都在95%以上，但其序列间个别氨基酸的差异也会导致对害虫毒力和杀虫谱的变化［3］。本试验采用的Vip3Aa39和Vip3Aa11蛋白氨基酸序列间仅存在39个位点的不同，但Vip3Aa39和Vip3Aa11对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫的杀虫活性差别较大，根据本实验室生物活性测定，Vip3Aa39对小地老虎的50%致死浓度（LC50）为5.43 μg/mL，而Vip3Aa11的LC5073.62 μg/mL；Vip3Aa39对小菜蛾的LC50为140.64 μg/mL，而Vip3Aa11对小菜蛾的杀虫活性极低；Vip3Aa11对棉铃虫LC50为35.18 μg/mL，而 Vip3Aa39 的LC50仅 为 286.99 μg/mL［6］。 所 以定位和分析Vip3A蛋白的功能特异性区域，对研究Vip3Aa蛋白的杀虫活性及杀虫谱具有重要意义。

现在，人们越来越关注对已有蛋白质的基因改造，发明了多种蛋白质突变体基因库构建方法［4］，其中就包括同源及非同源的多种重组方法。本研究选用了本实验室克隆的对小菜蛾等农业害虫生物活性不同的vip3Aa39［6］和vip3Aa11［7］基因为目的基因，将两个基因片段进行同源随机重组，得到一系列同源重组产物。将不同的重组产物利用Gateway［5］技术克隆到供体载体（Donor vector），构建一个Vip3A的随机重组文库。旨在获得高毒力、具有杀虫特异性的Vip3A蛋白的同时，也为进一步研究Vip3A类蛋白高毒力及杀虫特异性相关功能区域奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 转入重组质粒pEB-Vip3Aa39的Rosetta（DE3）菌株和转入重组质粒pET28a-Vip3Aa-11的BL21菌株为中国农业科学院植物保护研究所生物技术组实验室所有。pDONR221菌株购于Invitrogen公司。Escherichia coliJM109为实验室保存菌。

1.1.2 主要试剂和工具酶 Gateway BP Clonase Ⅱ E-nzyme Mix购自Invitrogen公司；2×TaqPCR Master-Mix、DNA Ladder Marker购自博迈德生物公司；PrimerSTAR Max DNA Polymerase 购自大连宝生物公司；质粒DNA小量提取试剂盒、PCR纯化试剂盒购自AxyPrep生物技术有限公司。PCR引物合成和测序委托上海生工生物工程有限公司。DNA marker：100 bp ladder plus 购自博迈德生物公司。其余试剂均为国产分析纯以上或进口超级纯产品。

1.1.3 培养基 液体LB：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。固体LB：在液体培养基中加1.5%琼脂。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的提取 利用质粒DNA小量提取试剂盒提取大肠杆菌中的质粒pEB-Vip3Aa39、pET28a-Vip3Aa11和pDONR221。

1.2.2 重组目的基因的引物设计 根据已得到的vip3Aa39、vip3Aa11序列和attB1、attB2位点序列，设计引物。由于attB位点序列过长，设计两步PCR。各引物名称及序列如下：VIP3AA39-5：GTACAAAAAAGCAGGCTATGAATAAT；VIP3AA39-3：TTACTTAATTGAGACATCGTTAAACTTTACAAGA；VIP3AA-11-5：ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGCACAAGA；VIP3AA11-3：GTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATAGAGACATCGT；attB1：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT（下划线为attB1、attB2的部分序列）。

1.2.3 重组质粒的构建 分别以pEB-Vip3Aa39，pET28a-Vip3Aa11质粒为模板，利用已设计引物 VIP3A-A39-5、VIP3AA39-3 和 VIP3AA11-5、VIP3AA11-3进行第一步PCR，分别在vip3Aa39基因的5'端加上attB1位点的部分序列，在vip3Aa11基因的3'端加上attB2位点的部分序列，且引物之间的长度为整个基因的完整序列；再分别以第一步PCR产物为模板，利用引物attB1、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、attB2，进行第二步PCR，分别使vip3Aa39基因的5'端加上attB1全位点序列，使vip3Aa11基因的3'端加上attB2全位点序列。

提取载体pDONR221质粒，将第二步PCR反应产物attB1-Vip3Aa39和Vip3Aa11-attB2分别用PCR纯化试剂盒进行纯化，最后用 Gateway BP重组试剂盒中的Gateway BP ClonaseⅡenzyme mix 2 μL 进行25℃［8］过夜重组反应，获得重组质粒。重组反应示意图见图1。

1.2.4 Vip3A随机重组文库的构建 重组质粒加入2 μL蛋白酶K，37℃温浴10 min，转化大肠杆菌JM109，挑取所有克隆。

1.2.5 阳性克隆的鉴定 将重组质粒进行PCR初步鉴定，测序由中国农业科学院重大科学工程开放实验室完成。根据测序结果，确定阳性克隆子。

2 结果

2.1 vip3Aa的PCR反应

图1 Gateway技术同源重组示意图

以质粒pEB-Vip3Aa39和pET28a-Vip3Aa11为模板，应用引物VIP3AA39-5、VIP3AA39-3和VIP3AA11-5、VIP3AA11-3扩增到带有部分attB1位点的vip3Aa39的目的产物和带有部分attB2位点的vip3Aa11的目的产物，结果见图2中1、2、3、4泳道。将PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化后，结果见图2中6、7泳道。

图2 vip3Aa39和vip3Aa11的第一步PCR扩增及纯化检测

以第一次PCR反应产物为模板，进行第二次PCR，结果（图3）显示，应用设计引物attB1和VIP3AA39-3成功得到带有attB1全位点的vip3Aa39目的产物（图3中1、2泳道），命名为attB1-vip3Aa39；应用设计引物VIP3AA11-5和attB2成功得到带有attB2全位点的vip3Aa11目的产物（图3中3、4泳道），命名为vip3Aa11-attB2。

图3 vip3Aa39和vip3Aa11的第二步PCR扩增检测

应用NanoDrop ND-1000核酸蛋白定量检测仪，对纯化后的PCR产物及提取的pDONR221质粒进行定量：attB1-vip3Aa39浓度为189.6 ng/L，vip3Aa11-attB2浓度为193.2 ng/L，pDONR221浓度为76 ng/L，结果显示，浓度能够达到Gateway BP重组试剂盒的要求。

2.2 重组质粒的构建和重组文库的确定

将初步鉴定的42个重组质粒进行测序。将测序结果用NCBI网站上的BLAST、Informax 2003 Vector NTI Suite 9、DNAMAN等软件分析，获得22个氨基酸序列不同的重组突变体，从而确定重组文库。

对Vip3Aa39、Vip3Aa11和22个突变体氨基酸序列差别位点进行统计，结果（图4）显示，有的突变体与Vip3Aa39的序列N端区别很大，有的与Vip3Aa11序列的C端差别很多，但都与Vip3Aa39和Vip3Aa11的氨基酸序列不同，并且这些突变体在Vip3Aa39和Vip3Aa11的39个氨基酸差异位点上都有体现。说明重组位点覆盖了两个材料基因的全部差异位点，并且重组位点的数目有一个由逐渐递增到递减的趋势，为之后研究材料基因的功能特异位点奠定了很好的基础。同时将22个突变体氨基酸序列到NCBI网站进行蛋白序列比对，得到的每个突变体都是新序列。

将得到的22个突变体氨基酸序列和vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列应用Vector NTI软件进行聚类分析，可看出各个突变体与vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的远近关系，结果（图5）显示，距离vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列较远的突变体，其氨基酸序列与vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差别较大，例如M1、M20、M21和M22，共4个突变较大的突变体，占总突变体的18%；反之，突变体的氨基酸序列与vip3Aa39和vip3Aa11的氨基酸序列的差别较小，例如M2和M12等。

图4 氨基酸突变位点统计分析

图5 Vip3A突变体氨基酸序列聚类图

3 讨论

目前国际上的同源重组方法主要包括DNA shuffling［9］、StEP［10］、RACHITT［11］、RETT［12］、NExT［13］、Golden Gate Shuffling［14］。这 6 种方法中，有的存在酶的消化条件难于控制，有的存在片段延伸时间难于控制等问题，步骤繁琐，都制约了重组的成功率。本研究采用Gateway技术及同源重组酶，步骤简单，只需一步重组反应，且反应条件易于控制，在25℃条件下就可进行重组，成功率高。利用Gateway技术，摆脱了传统载体构建中酶切连接的局限性。Gateway入门载体两端的接头不同，能够很好地解决目的基因连入的方向问题，未成功重组的载体由于仍然具有致死基因ccdB，而使普通大肠杆菌无法生长从而减少了假阳性的菌株，为后期的筛选工作节省了时间。

现在，人们主要应用Gateway技术的BP、LP反应来构建表达载体，例如2011年，徐品三等［15］应用Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体；阙文忠等［16］利用Gateway技术快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒；李明等［17］采用Gateway克隆技术构建了小麦TaWRKY46-1基因可诱导型超量表达载体；本研究利用同源重组酶对两个2.3 kb的全长基因进行同源随机重组，然后再通过由Invitrogen公司开发的Gateway［5］技术将不同的同源重组片段克隆到其供体载体上，构建突变体文库。利用此方法进行的同源随机重组，重组位点能够覆盖全部材料基因，重组材料及条件易于控制，操作简单；同时利用Gateway技术的BP重组反应将重组片段克隆到供体载体上，省去了普通克隆时的酶切连接鉴定的繁琐步骤，可直接将片段克隆到载体上，极大地提高克隆效率。

本研究运用Gateway重组酶通过对Vip3A类两个基因的随机重组获得了22个突变体，经氨基酸序列比对，差异较大的序列，说明突变位点较多，这可能会改变原有目的基因的功能；差异较小的序列，为今后定向研究材料基因的功能区域提供了研究对象。基于这些突变体在氨基酸序列上呈现的差异，我们将对这些突变体基因在大肠杆菌中进行重组表达，然后对每个突变体重组蛋白进行提取，并将其对鳞翅目昆虫如甜菜夜蛾、小菜蛾、小地老虎等进行生物活性测定，以期找到杀虫特异性强，杀虫谱广的杀虫蛋白。为研究Vip3A蛋白的特异性相关区域或氨基酸定位奠定基础，具有重要的理论意义和实用价值。

4 结论

应用Gateway技术中的BP反应对杀虫谱存在特异性的vip3Aa39和vip3Aa11基因进行同源重组突变，构建重组文库。获得42个基因型不同的重组质粒，其中有22个蛋白序列不同的突变体。

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