TRIP-1抗体的制作及应用

张宏玲 万骏 董一辰 曹威 张新胜 张锦勰 黄来强

（1. 清华大学生命科学学院，北京 100084；2. 清华大学深圳研究生院生命与健康学部生物医药研究中心和基因与抗体治疗重点实验室，深圳 518055）

TRIP-1（transforming growth factor-β receptor interacting protein）最初是在B细胞文库中使用酵母双杂交的方法，利用TGFβRⅡC端作为诱饵蛋白，发现的一个含有5个WD40重复结构域的蛋白，分子量为36 kD［1］。TRIP-1可以被TGFβ二型受体磷酸化。TRIP-1是TGFβ信号通路的调节子，可以抑制TGF-β所调控的血浆纤维蛋白溶酶原激活抑制因子-1（PAI-1）基因转录［2］，细胞迁移，表皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］和骨细胞的分化中起重要的调控作用［4，5］。TRIP-1也是一个与癌症密切相关的蛋白，被发现在多种癌症中高表达。另外，TRIP-1可作为eIF3i蛋白存在细胞内行使蛋白质翻译功能［6，7］。目前，TRIP-1的功能仍然还不很清楚。

抗体是研究蛋白功能至关重要的工具。TRIP-1蛋白被克隆17年以来，相关的研究文献并不多见，直到近两年才出现TRIP-1商业化抗体，但商业化抗体用量有限且价格昂贵。为了便于后续研究，本实验室通过动物免疫来生产大量TRIP-1特异抗体。首先，通过RT-PCR获得TRIP-1基因，并将其克隆到原核表达载体pET-His中，IPTG诱导表达TRIP-1蛋白。将诱导所得蛋白纯化后对试验动物进行免疫，一段时间后获取抗血清，经效价测定及纯化，制造的抗体用于Western blot和免疫荧光等试验，旨在为进一步研究该蛋白在真核细胞内的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pET-His-TRIP-1，重组大肠杆菌E. coliBL21（DE3）（携带质粒 pET-His-TRIP-1）为本实验 室 构 建 和 保 存 ；HeLa、HepG2、HEK293、CNE、NIH3T3细胞为本实验室储存；用于饲养哺乳动物细胞的DMEM培养基购自Gibico公司；新西兰大耳兔、昆明鼠购自广州实验动物中心；蛋白质marker购自Fermentas公司；HRP酶标二抗（抗鼠和抗兔）和FITC标记的二抗购自KPL公司，鬼笔环肽购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 TRIP-1蛋白原核诱导表达及纯化 随机挑取单克隆接种于5 mL含适量抗生素LB液体培养基中，于37℃、200 r/min条件下过夜培养。然后按2%接种量接种于200 mL含抗生素新鲜的LB液体培养基中，于37℃、200 r/min条件下继续培养。菌液浓度达OD600=0.6时加入终浓度0.2 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min条件下培养。IPTG诱导5 h，5 000 r/min离心5 min，收集菌体，用40 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液混合重悬，冰上进行超声处理。5 000 r/min离心，根据蛋白表达情况分别收集上清，沉淀。

1.2.2 包涵体的洗涤和纯化 由于TRIP-1蛋白在包涵体中，本研究采用尿素法纯化包涵体［8］，具体纯化方法如下：Ni-NTA His Binding·Resin 2 mL柱预处理：用5 mL去离子水洗涤；加0.5-1 mL NiSO4；再用5 mL去离子水洗涤。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+8 mol/L尿素平衡柱。上样准备好的包涵体溶液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+6 mol/L尿素溶解］，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪唑，1 mmol/L β-巯基乙醇（pH8.0）+8 mol/L尿素洗涤，收集流出液。用30 mL 20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0洗涤，收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0洗脱蛋白，收集1 mL/管，蛋白在此步收集。最后用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0洗涤，收集流出液。用10 mL去离子水洗涤柱子，充满20%乙醇，放在4℃冰箱保存。纯化的蛋白用SDSPAGE电泳检测。

1.2.3 TRIP-1兔抗血清制备 取2 mL TRIP-1蛋白（1.6 mg/mL）制品与等体积的弗氏完全佐剂（Freunds Adjuvant，complete）混合，在新西兰大耳兔背部选取4-6个点进行皮下多点接种，共接种4次，每次间隔14 d，第4次加强免疫后7 d耳缘静脉采血，分离血清，进行效价检测，获阳性结果后进行心脏取血，将血液收集到无菌的试管中，室温静置1-2 h，待血液凝固后转移到4℃冰箱中，放置过夜，至血清析出，将血清转移到无菌的离心管中，10 000 r/min、4℃离心30 min，取上清，保存于-70℃备用。

1.2.4 TRIP-1鼠抗血清制备 5只3-4周龄昆明小鼠，将200 μg抗原蛋白溶于250 μL生理盐水并与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，对小鼠进行皮下注射。首次免疫2周后进行第2次免疫，免疫原剂量减半，并用弗氏不完全佐剂乳化。第2次免疫后每隔7 d按照第2次免疫的方法继续免疫，第4次免疫之后第3天，尾部取血分离血清，进行效价检测，获阳性结果后，进行心脏取血，将血液收集到无菌的试管中，室温静置1-2 h，待血液凝固后，转移到4℃冰箱中，放置过夜，至血清析出，将血清转移到无菌的离心管中，10 000 r/min、4℃离心30 min，取上清，保存于-70℃备用。

1.2.5 ELISA检测抗血清效价 抗原包被：将抗原用包被液1∶4 000稀释（10 μg/mL终浓度），100 μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜。洗涤：次日倾去凹孔内的液体，PBST洗3次。封闭：加100 μL/孔3% BSA，室温放置0.5 h。洗涤：用PBST洗3次。

加待测样品（一抗）：将抗体血清在另一块板上用PBS连续稀释，100 μL/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，免疫前的血清作为阴性对照。加盖37℃恒温箱温育1 h。洗涤：用PBST洗3次。

加HRP酶标二抗：用封闭液1∶8 000稀释，100 μL/孔，加盖37℃恒温箱温育1 h。 洗涤：用PBST洗5次，蒸馏水洗2次。显色：加新鲜配制的底物溶液100 μL/孔暗处放置5-30 min，显示蓝色。终止反应，比色：加50 μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。

1.2.6 ELISA检测抗体相对亲和力 方法同1.2.5。用抗原包被酶标板，使用两个浓度梯度即0.5 μg/mL和1.0 μg/mL抗原包被，4℃放置过夜；以多抗浓度的对数为横坐标，A450值为纵坐标作图。以曲线达到水平的A450值为100%，求出A50，即50%的A450值时对应的抗体摩尔浓度。按照文献［9，10］的方法进行计算。

1.2.7 Western blot 检测 将收集的细胞加入SDS加样缓冲液，煮沸10 min，离心后取上清液进行SDSPAGE后电转移至PVDF膜上，以5%的脱脂牛奶封闭2 h，与自制兔抗人、鼠抗人TRIP-1的多克隆抗体4℃过夜，之后用TBST每10 min洗1次，共3次；加入相应二抗室温1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，曝光。

1.2.8 细胞免疫荧光 固定在盖玻片上的细胞用PBS漂洗3次，每次5 min；用3.7%的甲醛固定细胞，37℃ 10 min；0.1% TritonX-100透化10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；5%山羊血清（PBS配制）室温封闭1 h；去除山羊血清封闭液之后，直接加入5%BSA稀释的一抗，4℃杂交过夜。PBS漂洗5次，每次5 min；加入5% BSA稀释的二抗，室温避光杂交1 h；PBS漂洗5次，每次5 min；抗催灭封片剂封片，激光共聚焦荧光显微镜上观察。

1.2.9 ProteinG亲和层析柱纯化抗体 配制缓冲液：起始缓冲液为TBS缓冲液洗脱缓冲液为pH2.7 0.1 mmol/L甘氨酸盐酸；准备收集管：取1.5 mL离心管，每支离心管加70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl；样品准备：抗血清经TBS进行透析过夜，并经0.22 μm微孔滤膜滤过。

透析过的待纯化的样品15-25 mL上柱，流速为0.5 mL/min，将留出的样品反复过柱；然后以同样的流速用10-20倍体积的TBS缓冲液洗涤，去除未结合和非特异性结合的蛋白，可通过测定OD280的吸光度判定洗涤是否完全；洗脱缓冲液（pH2.7，0.1 mmol/L甘氨酸盐酸）6-7 mL每管1 mL收集洗脱液，测每管OD280吸收值。收集第2洗脱峰，BCA法测蛋白含量，4℃保存备用；纯化的抗体用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度用12%分离胶、5%浓缩胶，恒流下电泳2 h，考马斯亮蓝R250（Pharmacia）染色。

2 结果

2.1 TRIP-1蛋白的表达与纯化

利用构建好的pET-His-TRIP-1载体分别转化大肠杆菌BL21（DE3），成功地原核诱导表达TRIP-1全长蛋白，并且用纯化好的蛋白进行下一步试验，即免疫小鼠和新西兰大耳兔（图1）。

图1 TRIP-1蛋白的诱导表达及纯化结果

2.2 TRIP-1抗血清效价检测

将用TRIP-1蛋白抗原免疫4次之后的新西兰大耳兔以及小鼠抽取血清样本通过ELISA法测量抗体效价，计算阳性血清和阴性血清A450值之比（antiserum/preimmune serum，a/p），当a/p≥2.1时为阳性，当a/p<2.1而a/p≥1.5时为可疑，当a/p<1.5时为阴性。如图2所示，两种抗血清稀释倍数为106时，和阴性血清相比，仍呈现阳性反应，表明免疫后的两种抗血清的效价均达到106。

2.3 抗体亲和力检测

通过对纯化的兔抗人TRIP-1多克隆抗体进行相对亲和力检测测定，并且计算抗体亲和常数大约是105-106，可以进行相关免疫学试验（图3）。

2.4 利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况

图2 经免疫过的兔（A）和小鼠（B）的血清通过ELISA法测定效价

图3 TRIP-1兔抗相对亲和常数计算图表

利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况，各细胞及组织蛋白，12%蛋白胶PAGE电泳，将制作好的TRIP-1鼠源及兔源抗体用于Western blot试验，检测多种细胞和组织当中的TRIP-1表达情况。将所制备抗体5 000倍稀释用来检测真核细胞内源性TRIP-1蛋白表达情况，如图4所示，兔抗和鼠抗均能够很好地检测真核细胞内源性的蛋白表达，并且也能够直接检测从动物不同组织中抽提出来的蛋白。说明制备的抗体具有较高的灵敏度和特异性。

图4 Western blot检测TRIP-1鼠源（A）及兔源（B）抗体

2.5 细胞免疫荧光法检测TRIP-1蛋白细胞内定位

TRIP-1蛋白细胞免疫荧光检测，取HeLa细胞进行免疫荧光，用Phallodin-FITC染微丝（actin），同时用TRIP-1兔抗来检测其在细胞内的定位情况，二抗用rhodamine标记的羊抗兔抗体。荧光显微镜下拍照（图5）。将制备的TRIP-1兔抗人多克隆抗体200倍稀释进行细胞免疫荧光化学染色试验分析，发现制备的抗体能够进行细胞免疫荧光化学染色，且染色效果十分良好，同时发现，TRIP-1蛋白在细胞质内质网位置定位明显。

图5 TRIP-1蛋白细胞免疫荧光检测

2.6 TRIP-1抗体纯化

取免疫过的兔和鼠的抗血清，利用proteinG方法进行纯化，成功将2种抗体进行了初步纯化，从纯化结果（图6）中可以清楚地看到抗体重链（55 kD）和轻链（26 kD）。

3 讨论

图6 抗体纯化结果图

生命科学的研究，尤其是针对某个蛋白的功能研究，抗体是至关重要的工具。抗体可分为多克隆抗体，单克隆抗体等。单克隆抗体的特异性较好，但制作过程比较繁琐，多克隆抗体则制作较为容易。本研究通过原核诱导表达发现诱导的TRIP-1蛋白主要表达在包涵体当中，有文献报道用含尿素的缓冲液洗涤包涵体，可初步纯化目的蛋白，可以满足后续试验中对抗原的要求［11］。鉴于此，本试验选择用尿素法提取并洗涤纯化包涵体得到较为纯净的TRIP-1蛋白。采用直接免疫新西兰白兔和昆明鼠的方法获得抗血清。ELISA是检测抗体质量相关系数的重要手段［12，13］。本试验ELISA检测结果显示抗血清效价极高，并且计算出的亲和常数证明抗体可用于免疫学试验。未经纯化的抗血清，稀释很高的倍数仍可用于Western blot和免疫荧光等试验，且有非常好的特异性。细胞免疫荧光法检测TRIP-1蛋白细胞内定位发现，TRIP-1蛋白在细胞质内质网位置定位明显，此结果与发表的相关文献吻合［6］。同时，本研究通过proteinG的方法对多克隆抗体初步进行了纯化。以上结果表明，成功制备、纯化了特异性的TRIP-1多克隆抗体，为今后深入研究TRIP-1的生物学活性和与疾病的关系及可能的临床应用奠定了基础。

4 结论

本研究通过原核诱导表达和包涵体纯化，获得了较为纯净的TRIP-1全长蛋白。通过免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠，获得了抗血清。通过ELISA、Western blot和免疫荧光试验验证了抗体的效价和特异性。结果证明用这种方法可以制备具有较高特异性和灵敏度的多克隆抗体。

［1］ Chen RH, Miettinen PJ, Maruoka EM, et al. A WD-domain protein that is associated with and phosphorylated by the type ［J］. Nature,1995, 377（6549）：548-552.

［2］ Choy L, Derynck R. The type II transforming growth factor（TGF）-β receptor-interacting protein TRIP-1 acts as a modulator of the TGF-β response ［J］. J Biol Chem, 1998, 273（47）：31455-31462.

［3］ Perez RE, Navarro A, Rezaiekhaligh MH, et al. TRIP-1 regulates TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of human lung epithelial cell line A549 ［J］. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol,2011, 300（5）：L799-L807.

［4］ Metz-Estrella D, Jonason JH, Sheu TJ, et al. TRIP-1：A regulator of osteoblast function ［J］. Journal of Bone and Mineral Research,2012, 27（7）：1576-1584.

［5］ Ramachandran A, Ravindran S, George A. Localization of transforming growth factor beta receptor II interacting protein-1 in bone and teeth［J］. J Histochem Cytochem, 2012, 60（4）：323-337.

［6］ Ahlemann M, Zeidler R, Lang S, et al. Carcinoma-associated eIF3i overexpression facilitates mTOR-dependent growth transformation［J］. Molecular Carcinogenesis, 2006, 45（12）：957-967.

［7］ Asano K, Kinzy TG, Merrick WC, et al. Conservation and diversity of eukaryotic translation initiation factor eIF3 ［J］. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（2）：1101-1109.

［8］ 罗惠霞, 李敏, 王玉炯.包涵体蛋白复性的几种方法［J］.生物技术通报, 2007（5）：96-98.

［9］ Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay ［J］.Journal of Immunological Methods, 1987, 100（1-2）：173-179.

［10］ Ding G, Zhu J, Wang Z, et al. Measurement of scFv antibody affinity using non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay ［J］.南京医科大学学报（英文版）, 2005, 19（2）：4.

［11］ 秦睿玲, 张西臣, 李建华, 等.柔嫩艾美球虫间接ELISA检测方法的建立［J］.中国兽医科技, 2004, 34（7）：60-63.

［12］ 张小兵, 邸禄芹, 吴萌, 等.单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA 方法比较［J］.生物技术通报, 2009（11）：125-129.

［13］ 陈卓, 刘家驹, 毕亮, 等. NPR1多肽抗体的制备和应用［J］.生物技术通报, 2012（1）：145-150.