枇杷叶中三萜酸的提取、分离和检测研究进展*

2013-01-14李子溪

楚雄师范学院学报 2013年3期

李子溪，江岸

(楚雄师范学院化学与生命科学系，云南楚雄 675000)

1 前言

枇杷 (Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.)是蔷薇科 (Rosaceae)枇杷属植物，原产于我国，主要分布于中南及陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、贵州、云南等地。枇杷叶又名巴叶、芦桔叶，是传统医药学常用的中药，一般认为其味苦，性微寒，归肺、胃二经，具有抗炎抑菌、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等药理活性［1］。枇杷叶中含有三萜酸、黄酮、糖苷等多种化学成分，其药理作用主要集中在三萜酸上，因而有关枇杷叶中三萜酸的研究受到广泛关注。

2 枇杷叶中三萜酸的种类

枇杷叶中的三萜酸类化合物有十余种，主要为五环三萜类化合物，以乌苏烷型和齐墩果烷型居多，包括熊果酸 (乌索酸，乌苏酸，Ursolic acid)［2］及以熊果酸为母核的科罗索酸(2α －羟基熊果酸，Corosolic acid)［2］、2α，19α －二羟基－3－羰基－12－烯－28－乌苏酸(2α，19α －dihydroxyurs－3－oxo－12－en－28－oic acid)［2］、2α，3β，13β －三羟基－11－烯－28－乌苏酸 (2α，3β，13β －trihydroxyurs－11－en－28－oic acid)［2］、坡模酸 (Pomolic acid)［3］、蔷薇酸 (Euscaphic acid)［2］、委陵菜酸 (tormertic acid)［4］、2α，3α －二羟基－12－烯－28－乌苏酸 (2α，3α －dihydroxyurs－12－en－28－oic acid)［5］、2β，3β，19α －三羟基－12－烯－28－乌苏酸 (2β，3β，19α －trihydroxyurs－12－en－28－oic acid)。［5］、3β，6β，19α－三羟基－12－烯－28－乌苏酸 (3β，6β，19α － trihydroxyurs－12－en－28－oic acid)［6］、23－反式－对香豆酰委陵菜酸 (23－ trans－ p －coumaroyltormentic acid)［6］、23－顺式－对香豆酰委陵菜酸 (23－cis－p－coumaroyltormentic acid)［6］、3－O－反式－咖啡酰委陵菜酸 (3－O－tran－cafhyltormentic acid)［6］、3－O－反式－对香豆酰救必应酸 (3－O－ tran － p － coumaroylrotundic acid)［6］，齐墩果酸 (Oleanolic acid)［2］及以齐墩果酸为母核的2α，3α，19α，23－四羟基－12－烯－28－齐墩果酸 (2α，3α，19α，23－tetrahydroxyolean－12 －en－28 － oic acid)［2］、马斯里酸 (2α －羟基齐墩果酸，maslinic acid)［3］、阿江榄仁酸(ursolic acid)［7］、2α，3α，19α －三羟基－12 －烯－28 －齐墩果酸 (2α，3α，19α －trihydroxyolean－12－en－28－oic acid)［7］等多种三萜酸。其中，熊果酸和齐墩果酸的结构如图1所示。

图1 熊果酸和齐墩果酸的结构式Fig 1 Structure formula of ursolic acid and oleanolic acid

3 枇杷叶中三萜酸的提取

目前，从枇杷叶中提取三萜酸的方法主要有浸提法、回流提取法、超声辅助提取法、超临界CO2萃取法、微波提取法等。由于溶剂的毒性和三萜酸溶解度等原因，乙醇是最常用的提取溶剂，但也有使用甲醇［8］和乙醚［9］的报道。

回流提取法是较常用的提取方法，除了干燥［10］、粉碎［10］之外，原料亦可先经复合酶制剂发酵［11］或乙醚脱脂［12］预处理。不同的课题组分别研究了乙醇回流提取枇杷叶中熊果酸［13，14］、齐墩果酸［14］和科罗索酸［10］的工艺，发现除乙醇浓度之外，提取效率还受到粉碎粒度、料液比、温度等因素的影响，而提取时间和次数达到一定程度之后，提取效率不会继续提高。

李开泉等［15］比较了超声提取法与回流提取法对枇杷叶中熊果酸的提取效果，发现由于超声波具有特殊的机械、空化及热效应，加大了介质分子的运动速度，从而增强介质的穿透力，使有效成分得以充分溶出，提取的效率为热回流法的2.63倍。除了温度、料叶比、提取时间等因素之外，超声波的频率也对提取效果有显著影响［16］。

超临界CO2萃取技术以超临界CO2为溶剂，利用其溶解性和渗透能力，调节萃取体系的参数，使处于超临界状态下的流体对定组分的溶解度急剧增加，从而对混合物进行分离，克服了传统萃取方法中有机溶剂残留的问题。蒋盛岩等［17］利用超临界CO2萃取技术提取枇杷叶中的熊果酸，并对萃取条件进行优化，发现系统各参数影响程度为萃取温度＞萃取时间＞携带剂的添加量＞萃取压力。张慧恩等［18］则认为各参数影响程度应为萃取压力＞萃取温度＞动态萃取时间。

微波提取利用微波的热效应加热样品和有机溶剂，根据物质吸收微波能力的差异实现选择性加热，使得被萃取物质从基体或体系中分离，达到提取的目的，具有萃取效率高、产品纯度高等优点［19］。樊爱萍等［20］通过微波提取枇杷叶中齐墩果酸证明用微波提取的效果优于加热回流、冷浸提取，并优化了工艺条件。蒋珍菊等［21］则提出了完全不同的工艺参数。

4 枇杷叶中三萜酸的纯化

除各种三萜酸外，枇杷叶中还含有挥发油类、三萜酸类、黄酮类、皂甙类、有机酸类、多酚类等多种成分，这些物质在粗提物中大量存在，必须经过进一步处理，方可得到纯度较高的产品。粗提物的纯化方法有柱色谱法［4］、重结晶法［22］、HPLC法［23］等。

吕寒等［4］将浓缩后的粗提物经柱层析，用不同极性的溶剂梯度洗脱，得到的各组分再经反复层析，成功分离熊果酸、齐墩果酸、马斯里酸、蔷薇酸、科罗索酸、委陵菜酸等多种三萜酸。柱色谱分离之前，亦可先用不同溶剂萃取粗提物进行初步分离［2］。吴梨等［22］用大孔吸附树脂梯度洗提的方法处理枇杷叶乙醇提取物，并将得到的熊果酸粗产物进行5次重结晶，使产品中熊果酸纯度从不足10%提高到95.3%。李丽等［24］采用不同型号的大孔吸附树脂纯化熊果酸，也得到纯度95%的产品。

另外，李开泉等［25］用自制的除杂剂处理乙醇回流后的浸膏，除去脂类、树脂类及叶绿素等杂质，进一步纯化后得到熊果酸。相延英等［26］将反复洗涤并经活性炭脱色的样品重结晶，得到的熊果酸晶体纯度达94.0%。吕杨等［27］则用半制备HPLC分离了乙醇提取物中的科罗索酸和马斯里酸。

5 枇杷叶中三萜酸的分析检测

薄层层析法是较早的测定枇杷叶中三萜酸的方法。韩小龙等［28］以环己烷－氯仿－醋酸乙酯－冰醋酸为展开剂，测定不同含量的熊果酸标准样品在硅胶GF254板上展开后的斑点吸收峰峰面积，发现熊果酸在0.75～3.75 μg范围内时，含量与峰面积积分值呈良好的线性关系。另外，鲁湘鄂等［9］曾以氯仿－甲醇－冰醋酸为展开剂，用薄层色谱法对枇杷叶中的齐墩果酸进行定性鉴别。

除了薄层层析法之外，HPLC法也是测定枇杷叶中三萜酸含量的重要方法。胡长平等［29］以甲醇－醋酸水溶液为流动相，在C18色谱柱上实现科罗索酸与其他枇杷叶提取成分的分离，并借助色质联用技术，测定了科罗索酸的含量。邹盛勤等［30］则用Symmetry Shield RP18色谱柱和甲醇－水为流动相，测定了枇杷叶提取物中熊果酸的含量。

熊果酸和齐墩果酸是枇杷叶中含量最高的三萜酸，两者为互同分异构体，结构相似，分离较困难，HPLC法同时测定熊果酸和齐墩果酸含量的分析方法受到广泛关注。唐丽琴等［31］用多种流动相配合C18色谱柱测定枇杷叶中两种三萜酸，发现甲醇－水－冰醋酸是最理想的流动相。杜丰玉等［32］采用反相高效液相色谱法，比较了来自不同产地的10批枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量。陈龙胜等［33］则用反相高效液相色谱法同时测定了熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和山楂酸。

毛细管电泳法也被用于测定枇杷叶中三萜酸的含量。肖美添等［34］采用胶束毛细管测定枇杷叶中的熊果酸和齐墩果酸，并研究了背景电解质的种类和浓度、pH值、运行缓冲液对分离的影响。张锋等［35］采用毛细管区带电泳，高频电导检测枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸，考察了不同种类、不同浓度不同配比的缓冲溶液pH值、添加剂，优化了测试条件。

另外，何晓文等［12］采用冰醋酸－香草醛为显色剂，高氯酸为稳定剂，用分光光度法测定了枇杷叶中总三萜物质的含量。

6 总结

对枇杷叶中三萜酸提取、分离以及医学活性的研究，有助于更好地利用枇杷叶资源。但在枇杷叶中含有的各种三萜酸中，有关熊果酸和齐墩果酸的研究进行得比较深入，而科罗索酸等其它三萜酸的分离、检测报道较少。这些三萜酸的分离工艺、检测手段和生物活性还有待进一步研究。

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