登革病毒感染HepG2-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

陈艳雷，王娟，高娜，范东瀛，王一松，安静

首都医科大学基础医学院微生物学教研室，北京100069

登革病毒(dengue virus, DENV)是黄病毒属的单正股RNA病毒，主要由蚊虫叮咬传播，引起登革热和登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS)。近几年来，DENV的流行区域不断扩大。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，每年全球大约有25亿人面临DENV感染的危险[1]。目前既无特异性的抗病毒药物用于DENV感染的治疗，又无安全有效的疫苗可供预防接种，对其致病机制的研究也因缺乏理想的动物模型而无重大进展。既往本实验室利用严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠建立了DENV感染动物模型[2]，但该模型小鼠有后肢麻痹的神经系统损伤症状，脾脏注射操作亦较繁琐，客观上限制了其广泛应用。本研究拟对上述模型改良，用腹腔移植方法代替脾脏注射，建立DENV感染动物模型；同时，通过观察DENV感染小鼠的疾病特点，病毒在体内的分布和主要组织、器官的病理变化，对模型进行评价，期望为DENV致病机制的研究提供更为理想的工具和平台。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株与病毒株白纹伊蚊细胞株C6/36、非洲绿猴肾细胞株Vero由本实验室保存。人肝癌细胞株HepG2购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。DENV2(Tr1751 株)由日本国立传染病研究所保井孝太郎教授惠赠。在C6/36细胞中增殖DENV2，然后将病毒保存于-80 ℃备用。

1.1.2实验动物6周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雌性SCID小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，以无菌食物和饮用水饲养。

1.1.3抗体兔抗人白蛋白(human albumin,hALB)多克隆抗体、鼠抗人白蛋白单克隆抗体均购自美国Sigma公司。小鼠抗DENV2包膜E蛋白Ⅲ区单克隆抗体由南方医科大学珠江医院车晓燕教授惠赠。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记羊抗兔IgG抗体、Cy3标记羊抗鼠IgG抗体购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠腹腔移植HepG2细胞常规培养HepG2细胞。无菌条件下，SCID小鼠腹腔注射HepG2细胞悬液200 μl(约5×106个/只)。小鼠继续于无菌环境中饲养，每天定时观察其一般状态、腹腔包块生长程度。

1.2.2血清中hALB浓度测定采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测移植小鼠血清中hALB含量，以确定移植是否成功。基本步骤如下：兔抗hALB抗体稀释后加入96孔板，100 μl/孔，4 ℃过夜；次日加入待测血清，相继加入小鼠抗hALB单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，加入底物液显色；最后在酶标仪波长490 nm处测量其相应光密度(optical density，OD)值。

1.2.3HepG2-SCID小鼠的DENV2感染将移植成功的HepG2-SCID小鼠随机分成3组，每组7只。A组不进行病毒接种，用于观察移植HepG2细胞生长对小鼠一般状态的影响；B组用于观察DENV2感染对HepG2-SCID小鼠病死率的影响；C组用于检测DENV2感染后病毒在小鼠体内的增殖情况及器官损伤情况。B组和C组的感染实施方法为：于移植后第10天，无菌条件下腹腔接种DENV2, 剂量1×106PFU/只，无菌环境下继续饲养，每天记录小鼠一般情况； A组接种同等容量的细胞培养液。

1.2.4病毒滴度测定于HepG2-SCID小鼠感染DENV2后的第7天，乙醚麻醉，用眼球摘除法取血并分离血清，用病毒空斑实验(plaque assay)检测小鼠外周血中病毒滴度。

1.2.5HE染色DENV2感染HepG2-SCID小鼠后第7天，处死小鼠后进行解剖，取肝脏、脑组织，以常规方法脱水、透明，石蜡包埋。切片经脱蜡处理后先后置于苏木精(hematoxylin，H)、伊红(eosin, E)染液中染色，普通光学显微镜镜检。

1.2.6免疫荧光双染色切片脱蜡处理后，用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，加兔抗hALB抗体、小鼠抗DENV2包膜E蛋白Ⅲ区单克隆抗体，4 ℃过夜；次日分别加入FITC标记羊抗兔IgG抗体、Cy3标记羊抗鼠IgG抗体，37 ℃避光孵育1 h，40%甘油封片后荧光显微镜镜检。

2 结果

2.1 HepG2细胞移植后SCID小鼠的表现

所有小鼠于移植后7 d，腹部均明显有可触及的包块，随时间推移包块逐渐增大。移植后初期食欲及活动力尚可，无明显虚弱表现。移植后约40 d，小鼠出现皮毛不整，食欲减退，极度瘦弱，活动力差，并于移植后50 d左右逐渐死亡。小鼠死亡后立即进行解剖，肉眼观察如下：小鼠腹腔内肿瘤包块明显，呈单个或多个团块状分布，白色、质脆，个别较大包块直径可达1.5 cm(图1)。

移植后第5天和第10天，随机选取10只小鼠断尾取血，分离血清后，双抗体夹心ELISA法检测血清中hALB表达(图2)。10只小鼠血清均有hALB表达，且随着时间推移，hALB表达水平逐渐升高。结果表明，HepG2细胞在SCID小鼠中的移植成功率为100%。移植成功后的小鼠命名为HepG2-SCID小鼠。

图1HepG2-SCID小鼠腹腔肿瘤的大体解剖观察(箭头所示)

Fig.1AnatomyexaminationofHepG2-SCIDmice

图2移植后HepG2-SCID小鼠血清hALB水平变化(n=10)

Fig.2Changesinserumlevelsofhumanalbumin(hALB)inHepG2-SCIDmiceaftertransplantation

2.2 DENV2感染后HepG2-SCID小鼠的疾病表现

移植后第10天，HepG2-SCID小鼠腹腔注射DENV2，剂量为1×106PFU/只，观察小鼠一般状态及可能出现的疾病表现。感染后2 d小鼠即出现皮毛不整，随之出现食欲减退及精神萎靡表现，但1周内小鼠仍比较活跃。至第10天，小鼠出现疲倦、嗜睡等表现，并于感染后14～16 d死亡。整个发病过程中，虽然小鼠在后期有运动迟缓、恶病质等情况出现，但未有后肢瘫痪的神经系统症状。

2.3 DENV2感染后HepG2-SCID小鼠体内的病毒分布

DENV2感染HepG2-SCID小鼠后第8天，在小鼠血清、肝脏、脑、脾脏及小肠均可检测到病毒抗原表达，但分布趋势不同(图3)。血清和肝脏中病毒检出率高达100%，病毒滴度为103～105PFU/ml；脑、脾脏和小肠中病毒检出率分别为85.7%、71.4%和57.1%(n=7)，滴度<103PFU/ml。进一步采用免疫荧光双染色法检测肝内HepG2细胞与病毒抗原的共存，以hALB抗体定位HepG2细胞(绿色荧光)，以DENV2抗体定位DENV2病毒抗原(红色荧光)。结果显示，小鼠肝脏中有少数HepG2细胞定植，且定植的HepG2细胞内DENV2抗原明显分布于胞质区域(图4)。以上结果提示，移植的HepG2细胞能支持DENV2的感染和复制，能在小鼠体内出现病毒血症，说明腹腔注射方法简单、可行，且模拟了自然状态感染。

图3HepG2-SCID小鼠血清和主要脏器病毒滴度(n=7)

Fig.3VirustitersintheserumandorgansinHepG2-SCIDmiceafterDENV2infection

A: DENV2 antigen (Cy3-labelled). B: hALB antigen (FITC-labelled).

图4DENV2抗原在HepG2-SCID小鼠肝脏中的定位

Fig.4Co-localizationofDENV2antigenandhALBantigeninHepG2-SCIDmouseliver

2.4 DENV2感染后HepG2-SCID小鼠主要脏器的组织病理变化

DENV2感染后第8天，解剖小鼠，取各脏器，甲醛固定后进行石蜡包埋、切片，HE染色后镜下观察(图5)。HepG2-SCID小鼠在腹腔接种DENV2后，肝脏出现明显淤血、水肿和炎症细胞浸润，脑组织也有一定程度充血；而未感染DENV2的HepG2-SCID小鼠肝脏和脑未见明显病变。两组小鼠脾脏和小肠均未见明显病变。

A: Liver of uninfected HepG2-SCID mice; B: Live of DENV2-infected HepG2-SCID mice; C: Brain of uninfected HepG2-SCID mice; D: Brain of DENV2-infected HepG2-SCID mice.

图5DENV2感染后HepG2-SCID小鼠肝脏和脑的病理改变(箭头所示器官淤血或充血)

Fig.5PathologicalexaminationoftheliverandbrainintheHepG2-SCIDmiceafterDENV2infection

3 讨论

深入研究DENV感染的致病机制及其预防手段的主要障碍仍是缺乏合适的动物模型，理想的动物模型应是DENV以自然感染方式感染免疫功能正常的宿主，引起的症状与人类发病相似[3]。目前，DENV感染的动物模型主要有以下3种：人源细胞移植免疫缺陷小鼠的人鼠嵌合模型[4]、基因敲除小鼠(AG129、A/J等)模型[5-8]和少数正常免疫活性小鼠模型[9,10]。上述模型均具有一定的不足之处，尽管大多数小鼠模型可部分复制人类DENV感染的部分症状，如出血、血浆渗出、病毒血症和肝脏损伤等，但人类DENV感染中极为罕见的中枢神经系统症状如后肢麻痹等在很多小鼠模型中出现。AG129 小鼠被同时敲除了干扰素(interferon，IFN)-α/β和IFN-γ 受体，由于缺乏IFN受体，对病毒感染较敏感，是研究DENV时应用最广泛的动物模型[8]，但目前国内尚未引进。因此，研发较为经济、实用的动物模型十分必要。

有研究证实，从DHF/DSS患者肝脏中可分离到病毒颗粒[11]。临床观察发现，除出血症状外，DHF/DSS患者多伴有肝大、黄疸、氨基转移酶升高和部分凝血活酶时间延长等肝损伤表现[12-14]，少数患者甚至发生急性肝衰竭[15,16]；体外培养的人肝癌细胞株(Huh7、Hep3B、HepG2等)均支持DENV的复制、增殖[17]。因此，肝脏被认为是DENV感染的重要靶器官之一。在既往工作中，我们将HepG2细胞经脾脏注射移植给SCID小鼠，建立DENV感染动物模型[2]。本研究在此基础上进行改良，将HepG2细胞脾脏注射移植改为腹腔移植。细胞移植后5 d，小鼠血清hALB检出率达100%，且hALB水平随时间推移逐渐升高，说明移植的HepG2细胞在SCID小鼠体内生长良好。此外，HepG2移植后初期对小鼠的一般情况影响不大，后期小鼠一般状况逐渐变差，直至移植后50 d左右死亡，而DENV感染后的HepG2-SCID小鼠生存期仅为14～16 d，说明感染后HepG2-SCID小鼠死亡是由DENV感染导致而非肿瘤细胞移植所致。DENV2感染HepG2-SCID小鼠后，可出现明显的病毒血症和脏器损伤。DENV2感染后第8天，小鼠血清及肝脏的病毒检出率为100%，滴度达103～105PFU/ml，其他组织(脑、脾脏、小肠)病毒检出率和滴度相对较低。免疫荧光双染色显示小鼠肝脏有少数HepG2细胞定植，而在定植HepG2细胞内可检出DENV2抗原。HE染色发现HepG2-SCID小鼠在DENV2感染后第8天出现出血、淤血、水肿和炎症细胞浸润等严重肝损伤表现，与诸多研究结果一致[2,18]。

本研究结果表明，腹腔移植的HepG2细胞能支持DENV2在体内复制，并部分复制人类DENV感染症状，如病毒血症和肝损伤等。更为重要的是，腹腔移植HepG2的SCID小鼠感染病毒后未出现后肢瘫痪等无关症状。与脾脏移植相比，更简单、易行，这进一步说明腹腔移植HepG2细胞是一种可广泛应用的构建DENV感染动物模型的方法。综上所述，本研究构建的DENV2感染HepG2-SCID嵌合小鼠为研究DENV感染机制提供了较为理想的动物模型。

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