双示踪剂Micro-PET显像评价大鼠心肌缺血模型

万卫星，薛杨波，王 燕，瞿凌晨，许波华，杨 敏

(1.江苏大学附属医院 无锡市第四人民医院 核医学科，江苏 无锡 214063； 2.南京军区南京总医院 核医学科，江苏 南京 210002； 3. 无锡江原安迪科分子核医学研究发展有限公司， 江苏 无锡 214063； 4. 江苏省原子医学研究所 卫生部核医学重点实验室 江苏省分子核医学重点实验室，江苏 无锡 214063)

冠心病是一种由冠状动脉器质性狭窄或阻塞引起的心肌缺血缺氧或心肌坏死的心脏病。冠心病发病率逐年提高，且呈年轻化趋势，据《中国心血管病报告2011》报道，截止到2011年，患冠心病人数已达2.3亿，冠心病已被称作“人类健康的第一杀手”[1]。临床前对于冠心病心肌梗死的发生机理、防治方法等的研究，以结扎冠状动脉的心肌梗死模型为主[2-5]，大鼠因造价低廉，饲养方便，冠状动脉侧支循环少，心肌坏死出现早，心率失常发生率高，重复性及稳定性好，成为制作心肌缺血模型的首选试验动物[6-9]。

传统方法评价冠状动脉结扎法建立大鼠心肌缺血模型以心电图出现T波改变为标准[4]。但此法存在不足：(1)由于方法本身以及手术的影响使得心功能检测易出现多变性，个体差异较大[10]；(2)心电图的检测具有时效性，只能在术前和术后半小时内进行短时间检测[11]；(3)存在一定的假阳性，与病理学心肌TTC染色验证结果不符。模型建立的成功与否，是研究心肌缺血疾病的基础，鉴于传统方法评价心肌缺血模型存在一定的不足，急需寻求精准评价心肌缺血模型的方法。

血流灌注显像剂13NH3·H2O和葡萄糖代谢显像剂18F-FDG已广泛应用于临床，两种显像剂联合的PET显像是评价心肌存活的“金标准”[12-13]，可以对缺血心肌存活、预后和疗效进行客观评估。临床上采用18F-FDG代谢联合13NH3·H2O灌注显像来对心肌缺血程度进行评价，本研究拟采用13NH3·H2O 联合18F-FDG Micro-PET显像评价临床前心肌缺血大鼠模型，与传统T波改变的评价方法进行比较。

1 实验材料

1.1 主要仪器与装置

Sumitomo HM-7型医用回旋加速器：日本住友；Sumitomo HM-10型医用回旋加速器：日本住友；18F-FDG专用合成模块：北京派特；Mini-Scan TLC薄层放射性扫描仪：美国Bio SCAN公司；Matrx VMR型麻醉机：美国MATRX公司；Inveon型Micro-PET扫描仪：德国SIMENS公司；CURIEMENTOR 3型活度计：德国PTW公司；ALC-V小动物呼吸机：上海奥尔科特生物科技有限公司； XD-7100型心电图机：上海医用电子仪器厂；AC 210S型电子天平：德国Sartorius公司；A10超纯水系统：美国Millipore公司；宠物剃毛机：飞利浦公司。

1.2 主要试剂与耗材

异氟烷麻醉剂：美国 Minrad Inc公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)：美国sigma公司；水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司；生理盐水：江苏四环生物制药有限公司；碘酒：上海利康消毒高科技有限公司；青霉素：中诺药业(石家庄)有限公司；CM柱：美国 Waters公司；QM柱：美国 Waters公司；H216O水、H218O：上海化工研究院。

1.3 实验动物

12只SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

2 实验部分

2.1 13NH3·H2O制备

参照文献[14-15]，稍作改进，方法简述如下：采用Sumitomo HM-10型医用回旋加速器，

利用16O(p，α)13N核反应，经戴氏合金(Devarda’s alloy)还原靶水，制备出13NH3·H2O的生理盐水注射液，并经CM柱纯化。活度计测定13NH3·H2O不同时间的活度，用半对数作图法测定半衰期，计算核纯度。TLC法测定产品的放化纯度，展开剂为V(丙酸)∶V(丙酮)∶V(水)=1∶3∶2的氯化钠饱和溶液，载体为薄层层析硅胶板GF254。

2.2 18F-FDG制备

参照文献[16-18]，稍作改进，方法简述如下：采用Sumitomo HM-7型医用回旋加速器，通过18O(p，n)18F核反应和亲核取代反应，在FDG专用模块中全自动合成18F-FDG，产品经TLC法测定放化纯度，展开剂为95%乙腈，载体为薄层层析硅胶板GF254。

2.3 大鼠心肌缺血模型的建立

参照文献[10-11]，稍作改进，简述如下：大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mg∕100 g)。麻醉后将大鼠仰卧位固定，颈部胸部剪毛并酒精消毒，于颈部开一小口暴露气管，分离气管并插管，连接小动物呼吸机(频率48次/min，吸呼比1/2，潮气量20 mL/kg)。于左锁骨中线处纵向剪开胸部皮肤约2 cm，钝性分离肌肉层，于心脏搏动最强处开胸(在2至3肋间)。充分撕开心包膜，用环形钩将心脏提出胸腔，在左心耳根部下方2 mm处进针，6-0号丝线结扎冠状动脉左前降支。结扎后迅速将心脏纳回胸腔，缝合胸壁。拔去呼吸机，使其恢复自主呼吸。全过程无菌操作。

2.4 传统方法评价大鼠心肌缺血模型

2.3节中，大鼠于麻醉后，参照人体相应位置，在四肢皮下插入小动物心电图检测仪的针电极，动态检测建模前后肢体Ⅱ导联心电图。以结扎后心电图T波改变为模型评判标准。

2.5 Micro-PET显像

2.1节中大鼠于建模前、后均行13NH3·H2O合并18F-FDG显像。

2.5.113NH3·H2O显像

大鼠于Micro-PET扫描前禁食6 h，称重后，利用异氟烷--氧气混合气体(1.5%)麻醉待扫描大鼠，固定于Micro-PET扫描床上，每只尾静脉注射10 MBq新鲜制备的13NH3·H2O，注射体积为0.2 mL，注射5 min后，行Micro-PET扫描显像，层厚0.78 mm，矩阵128*128，采集时间10 min，采集能窗350～650 keV。

2.5.218F-FDG显像

2.5.1节中大鼠经13NH3·H2O注射后2 h注射18F-FDG进行显像，方法简述如下：异氟烷麻醉，尾静脉注射新鲜制备的18F-FDG，每只10 MBq，注射体积为0.2 mL，注射后，大鼠置于恒温麻醉舱中，维持麻醉状态，注射后60 min，行Micro-PET扫描显像，扫描方式同13NH3·H2O显像。

2.5.3数据处理

13NH3·H2O 和18F-FDG 的Micro-PET扫描图像采用OSEM 3D迭代重建，迭代2次，勾画心肌为感兴趣区，根据公式

SUVmean=衰减校正后的平均感兴趣区域的放射性活度/每克体重的注射性示踪剂注入活度

计算建模前后心肌的放射性物质标准摄取平均值(SUVmean)，缺损心肌和完整心肌的体积(VOI)及异常心肌占全心体积的百分比。

2.5.4统计学方法

利用SPSS 19.0软件先经方差齐性检验，若方差齐再进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性，P<0.01为有极显著性差异。

2.6 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法验证

显像结束后，迅速剪下模型大鼠心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等心肌组织，吸取水分，称全心重量。从心尖至心底将心脏切成1～2 mm的切片，放入浓度为2%的TTC溶液中，37 ℃水浴染色15 min，染色后洗去多余染料。梗死部分不被染色，未梗死部分呈红色。切取梗死区称重，计算梗死心肌占全心重量的百分比即为梗死率。

3 结果与讨论

3.1 13NH3·H2O制备

经半对数作图法测定13NH3·H2O 半衰期约为10 min，核素纯度>99%，TLC质控结果显示，13NH3·H2O产品Rf=0.7，放化纯度>99%。

3.2 18F-FDG制备

18F-FDG产品TLC质控结果显示，产品18F-FDG的Rf=0.43，其放化纯度>99%。

3.3 传统方法评价大鼠心肌缺血模型

12只大鼠在进行冠脉结扎法建立心肌缺血模型的手术结束后，立即观测大鼠心电图，与正常组心电图相比(图1a)，9只出现了T波明显变化(图1b)，视为结扎正确，模型成功。1只大鼠在结扎时出现室颤，未出现T波明显改变，视为模型不成功，1只大鼠为麻醉意外死亡，1只因为急性心衰死亡。

a—正常大鼠心电图；b—心肌缺血模型鼠心电图图1 心肌缺血模型鼠心电图Fig.1 The ECG of myocardial ischemia rat

3.4 Micro-PET显像

建模前，12只大鼠均利用血流灌注显像剂13NH3·H2O在注射后5 min进行Micro-PET显像，静态扫描图显示12只大鼠心肌血流灌注全部正常，整个心肌摄取放射性物质13NH3·H2O均匀，心肌标准摄取平均值为3.78±0.59，Micro-PET扫描图示于图2a，由图2a显示心肌完整；利用葡萄糖代谢显像剂18F-FDG在注射60 min后进行Micro-PET显像，静态扫描图示于图3，由图3显示12只大鼠心肌完整，葡萄糖代谢全部正常，心肌18F-FDG摄取均匀，心肌标准摄取平均值为2.30±0.21。

建模后的10只大鼠，利用血流灌注显像剂13NH3·H2O在注射后5 min进行Micro-PET显像，静态扫描图显示4只大鼠心肌血流灌注显像与建模前一致；6只心肌血流灌注异常，部分心肌摄取放射性物质13NH3·H2O明显低于其他大部分心肌，整个标准摄取平均值为2.78±0.46(图2b)。利用葡萄糖代谢显像剂18F-FDG在注射60 min后进行Micro-PET显像，静态扫描图显示4只大鼠Micro-PET显像与建模前一致，6只大鼠心肌糖代谢异常，部分心肌摄取放射性物质18F-FDG明显低于其他大部分心肌，整个标准摄取平均值为1.65±0.21(n=6)(图3b)。13NH3·H2O和18F-FDG的联合显像结果显示，传统方法心电图显示的9只建模成功的大鼠中，仅有6只发现心肌灌注和葡萄糖代谢均异常。

3.5 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法验证

13NH3·H2O和18F-FDG 的Micro-PET图像显示心肌摄取异常的6只大鼠，TTC染色后图片显示有部分心肌呈苍白色(图4)，TTC、心电图监测、Micro-PET三种评价结果一致，确认为建模成功。

Micro-PET显像正常的4只大鼠，其中3只在建模时，心电图出现了T波变化，但在解剖后TTC染色时，染色均匀，无异常(见图5)；另1只在建模时，心电图显示无T波改变， TTC染色均匀。TTC和Micro-PET评价结果一致，心电图评价假阳性。

心电压评价、Micro-PET评价及TTC染色结果比较列于表1。Micro-PET方法评价大鼠心肌缺血模型成功的正确率为100%，而传统心电图检测的方法评价大鼠心肌缺血模型成功的正确性仅为66.67%。

a—建模前；b—建模成功图2 13NH3·H2O的Micro-PET扫描图Fig.2 The Micro-PET scan picture of 13NH3·H2O

a—建模前；b—建模成功图3 18F-FDG的Micro-PET扫描图Fig.3 The Micro-PET scan picture of 18F-FDG

动物编号心电图结果13NH3·H2O显像18F-FDG显像TTC染色SUVmean建模前建模后*灌注异常心肌体积百分比(%)SUVmean建模前建模后#代谢异常心肌体积百分比(%)梗死率(%)1+4.313.2428.362.091.6725.4645.862+3.262.3724.952.451.5228.4027.393+4.283.1918.321.961.4119.4221.874+3.693.0030.432.131.8623.8135.695+3.942.8929.611.821.4435.4646.616+2.691.9733.342.631.9821.3938.477+2.872.960.002.332.690.000.008+4.224.080.001.851.940.000.009+3.893.850.002.292.110.000.0010-3.743.810.002.312.470.000.00

注：*：与建模前相比，建模成功的6只心肌摄取13NH3·H2O有统计学差异，p<0.05；

#：与建模前相比，建模成功的6只心肌摄取18F-FDG有统计学差异，p<0.05；

图4 心肌缺血大鼠心脏TTC染色图Fig.4 The TTC staining picture of ischemical myocardical

图5 正常大鼠心脏TTC染色图Fig.5 The TTC staining picture of normal myocardical

4 小结

(1)双示踪剂13NH3·H2O和18F-FDG的Micro-PET显像已经是临床评价心肌存活的“金标准”。但此法用于临床前动物模型的评价鲜有报道。本研究尝试用此法评价啮齿类动物心肌缺血模型，为建立抗心肌缺血药物开发的Micro-PET评价平台奠定基础。

(2)与传统的心电图监测方法相比，Micro-PET显像技术可以从分子水平、功能代谢方面评价心肌缺血，大大提高了评价方法的准确性；与TTC方法相比，Micro-PET显像技术可实现连续、动态、活体、无创成像。

综上所述，13NH3·H2O 联合18F-FDG Micro-PET显像技术在评价心肌缺血模型具有独特的优势和广阔的应用前景。

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