腺瘤性大肠息肉中DNA甲基转移酶mRNA的表达改变

张 伟 张颜波 张 姝 姜树原 栗 鹏 孟宪梅 邵 国

(1.包头医学院第二附属医院消化科，内蒙古 包头 014030； 2. 泰山医学院附属医院神经内科, 山东 泰安 27100； 3.包头医学院生物医学研究中心及基础医学院，内蒙古 包头 014060)

腺瘤性大肠息肉(colorectal adenomatous polyps，CAP)到癌的顺序学说即绝大部分大肠癌是由腺瘤或经过一定的腺瘤期演变而来,目前已得到了公认：最初的正常的上皮细胞过度增生，隐窝灶和腺瘤的形成，并最终过渡到具有浸润的大肠癌(colorectal cancer，CRC)[1]。众所周知，异常DNA甲基化是一些病理现象的原因，癌症一般均表现为整体基因组甲基化降低和抑癌基因启动区甲基化升高，这些甲基化变化导致染色体结构改变和基因表达发生异常。在大肠息肉中也存在着整体基因组甲基化降低和抑癌基因启动区高甲基化的现象[2-3]，因此，在DNA甲基化方面大肠息肉的发生可能与癌症有某些相似之处。

DNA的甲基化是靠DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT) 催化完成的。虽然有异常甲基化现象在大肠息肉中的报道，但DNMT在其中的作用尚未见报道，本研究用real-time PCR技术检测了腺瘤性大肠息肉及正常的大肠粘膜组织中三种DNMTs(DNMT1、3A和3B mRNA)表达, 探讨DNMTs mRNA在腺瘤性大肠息肉发生发展中的作用, 以期进一步了解腺瘤性大肠息肉的发生机制。

1 材料与方法

1.1 标本及试剂

7例CAP和7例正常大肠粘膜样本均来自包头医学院第二附属医院的新鲜标本；Trizol, Invitrogen; superscripⅡRT 酶(1 ×108U/ L ) , Invitrogen ; 随机引物(0. 5 g/ L) , 2×PCR mix(南京凯基)；焦碳酸二乙酯(DEPC) ,Sigma ；其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 引物

根据文献和Genebank序列，用Primer premier 5.0软件分别设计DNMT1、3A和3B及内参β-actin基因的引物。引物由上海生物公司合成，引物序列如下[4]。

β-actin F： 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'；

β-actin R： 5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'；

DNMT3A F : 5-GACAAGAATGCCACCAAAGC;

DNMT3A R: 5-CGTCTCCGAACCACATGAC;

DNMT1F：AACCTTCACCTAGCCCCAG；

DNMT1R：CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA；

DNMT3B F：AGGGAAGACTCGATCCTCGTC；

DNMT3B R： GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG；

1.3 RT-PCR及real-time PCR

RT-PCR：用Trizol提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度和含量。按照逆转录反应试剂盒进行反转录PCR，得到20 μl cDNA产物-20℃保存。使用ABI的96孔板，每孔依次加入cDNA 1μl，2×mix 12.5 μl，3′和5′端引物(5μmol·L-1) 各1 μl，无菌水9.5 μl，在ABI 7900 real-time PCR反应仪上反应，每个样本设3个复空。反应参数：94 ℃预变性3 min，再进行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s(40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反应。

1.4 数据分析及统计学处理

2 结 果

腺瘤性大肠息肉和正常粘膜组织中DNMT 1mRNA对β-actin mRNA的相对丰度值分别是1.02×10-3±4.87×10-4和8.67×10-4±2.18×10-4, 大肠息肉组织中与正常粘膜组织中DNMT1表达无显著差异(P>0.05)(图1)； 腺瘤性大肠息肉和正常粘膜组织中DNMT3A mRNA对β-actin mRNA的相对丰度值分别是3.26×10-2±4.96×10-3和3.00×10-2±5.20×10-4,两组在DNMT3A mRNA表达上无显著性差异(P>0.05)(图2)； 腺瘤性大肠息肉和正常粘膜组织中DNMT 3B mRNA对β-actin mRNA的相对丰度值分别是3.26×10-2±4.96×10-3and 3.00×10-2±5.20×10-4，大肠息肉组织中与正常粘膜组织中DNMT 3B表达有显著差异(P<0.05)(图3)。

图1 DNMT1 mRNA 对β-actin mRNA相对丰度图 CAP：腺瘤性大肠息肉； N：正常大肠粘膜

图2 DNMT3A mRNA 对β-actin mRNA相对丰度图 CAP：腺瘤性大肠息肉； N：正常大肠粘膜

图3 DNMT3B mRNA 对β-actin mRNA相对丰度图 CAP：腺瘤性大肠息肉； N：正常大肠粘膜

3 讨 论

基因5′的CpG岛中C的甲基化与基因表达变化密切相关[5]，有研究显示大肠腺瘤性息肉中有抑癌基因的异常甲基化和基因沉默现象[6]，而这种DNA甲基化的变化与肿瘤的DNA甲基化变化相同或相似，可能是其癌变的重要原因。催化DNA甲基化的酶为DNA甲基转移酶(DNMT)，其可以将S腺苷甲硫氨酸上(SAM)的甲基转移到DNA中胞嘧啶第五位碳原子上，到目前为止发现的3种的有甲基转移酶活性的DNMT为DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，其中DNMT1的底物是半甲基化的双链DNA，DNMT3A和DNMT3B的底物为没有甲基化的双链DNA[7]。由于大肠息肉中有异常甲基化现象，而DNMT在此过程中可能有重要作用，因此本研究对3种有甲基转移酶活性的DNMT在腺瘤性大肠息肉中的表达情况进行研究。

本研究结果显示DNMT1和DNMT3A mRNA在腺瘤性大肠息肉和正常粘膜组织没有显著性差异，而DNMT3B mRNA在正常粘膜组织和大肠息肉中有显著差异(P<0.05)，大肠息肉中DNMT3B的mRNA表达增加。Guo等研究显示在中国青年汉族人群中DNMT3B单核苷酸多态性是大肠息肉的一个易感因素[8]，Ibrahim等报道在应用免疫组织化学发现从正常组织到增生，从腺瘤性大肠息肉到大肠癌中DNMT3B表达增加[9]。所以DNMT3B可能在腺瘤性大肠息肉的发生和发展中起到了重要作用。Chen等报道在不同类型癌症中，最显著的是DNMT3B的过表达而不是DNMT3A和DNMT1过表达[10]。因此在腺瘤性大肠息肉中，DNMT的变化情况很可能是与癌症相似：DNMT3B过表达。

腺瘤性大肠息肉发展成与大肠癌的几率与其直径密切相关，直径1 cm以下的腺瘤性大肠息肉约有10%的病人发展成大肠癌，而直径2 cm以上腺瘤性大肠息肉的病人约有50%的发展成大肠癌。本研究并没有区分样本直径与DNMTs表达的关系，同时本研只是初步(7例腺瘤性大肠息肉和7例正常大肠粘膜)研究DNMT1、DNMT13A和DNMT13B在腺瘤性大肠息肉的发生和发展的作用。要明确DNMTs在腺瘤性大肠息肉的发生发展中的作用，特别是DNMT3B的作用，则需要增加研究样本数和区分样本直径等更深入的工作。明确DNMT1、DNMT3A和DNMT3B各自在大肠息肉的发生和发展中的作用，特别是它们在抑癌基因甲基化中的作用，对于大肠息肉的治疗有重要意义。

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