东北贯众中多糖的提取及含量测定

李瑞丽，张义卓，赵景明

(1.长春中医药大学 研究生学院，吉林 长春 130117；2.通化东宝药业股份有限公司)

东北贯众为鳞毛蕨科多年生草本植物粗茎鳞毛蕨的干燥根茎和叶柄残基，首载于《神农本草经》，又名“贯众”、“绵马贯众”，主产于我国东北黑龙江、吉林、辽宁三省山区，是常用中药．该药味苦而性微寒，具有清热解毒、凉血止血、杀虫等功效，临床适用于风热感冒、温热病发斑、痄腮、便血、崩漏等多种疾病的治疗．近年来，有关东北贯众的成分研究多集中在绵马贯众素、绵马素、绵马次酸等方面，对其所含多糖类成分尚无研究报道．因此对东北贯众中多糖类成分进行研究具有重要意义．本研究采用苯酚-硫酸法，对东北贯众药材中所含多糖的含量进行测定．

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

SLQ-1000F型超声分散仪(广州声联超声波电子科技有限公司)；XP205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Tu-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；东北贯众采自通化市山区，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨的干燥根茎和叶柄残基；苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯．

1.2 方法

(1)东北贯众多糖的提取与精制．精密称取100g过二号筛的东北贯众干燥药材粉末，以90%乙醇浸提脱脂2次，6h/次，滤取药渣，于通风橱中将残留乙醇挥散，继以水提醇沉方法提取多糖：将上述挥尽乙醇的药渣加蒸馏水1000mL，于60℃下超声提取，提取时间为30min，过滤，滤液另存，滤渣按上述提取方法再提取2次，合并3次提取得到的滤液，浓缩至100mL，用Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白后，离心得到上清液，加95%乙醇，使乙醇含量达到80%，置于4℃冰箱中过夜，12h后过滤，弃滤液，将滤渣依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，挥散溶剂，即得东北贯众精制多糖．

(2)5%的苯酚溶液的配制．精密称取苯酚100g，置于蒸馏装置中，另加0.05gNaHCO3、0.1g铝片，蒸馏提取，收集182℃下的馏分．精密称取5g馏分，以少许蒸馏水溶解后，定容于100mL棕色容量瓶中，摇匀，即得5%的苯酚溶液．

(3)葡萄糖标准溶液的配制．精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品25mg，以少许蒸馏水溶解后，定容于250mL棕色容量瓶中，摇匀，即得葡萄糖标准溶液，其浓度为0.1mg/mL．

(4)东北贯众多糖溶液的配制．精密称取105℃干燥至恒重的东北贯众多糖25mg，以少许蒸馏水溶解后，定容于250mL容量瓶中，摇匀，即得东北贯众多糖溶液，其浓度为0.1mg/mL．

(5)供试样品溶液的配制．精密称取过二号筛的东北贯众干燥药材粉末0.2g，以90%乙醇浸提脱脂2次，6h/次，滤取药渣，于通风橱中将残留乙醇挥散，继以水提醇沉方法提取多糖：将上述挥尽乙醇的药渣加蒸馏水20mL，于60℃下超声提取30min，过滤，滤液另存，滤渣按上述提取方法再提取2次，合并3次提取得到的滤液，定容于250mL容量瓶中，即配成供试样品溶液．

(6)检测波长的确定．精密吸取1.2(4)项东北贯众多糖溶液和1.2(3)项葡萄糖标准溶液各1.0mL，分别置于两支试管内，以蒸馏水为空白对照，分别加入1.2(2)项的苯酚溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，静置5min，40℃恒温水浴中加热30min，随即在400～800nm波长范围内进行扫描．结果显示，东北贯众多糖溶液和葡萄糖标准溶液的最大吸收波长均为490nm，故确定检测波长为490nm．

(7)线性关系考察．精密吸取1.2(3)项配置的葡萄糖标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL置于干燥试管中，分别补充蒸馏水至1.0mL，再分别加入1.2(2)项的苯酚溶液1.0mL，摇匀，加浓硫酸5.0mL，摇匀，静置5min，40℃恒温水浴中加热30min，随即将上述溶液在分别于490nm波长处测定吸光度．以葡萄糖标准溶液浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标进行线性回归，计算回归方程．

(8)换算因子的测定．精密吸取1.2(4)项东北贯众多糖溶液1.0mL，按1.2(7)项方法测定吸光度，根据回归方程计算出多糖中葡萄糖浓度，按下式计算换算因子(f)：f=多糖质量/(多糖中葡萄糖浓度×多糖的稀释因子)．

(9)精密度试验。精密吸取1.2(5)项东北贯众供试样品溶液1.0mL，按1.2(7)项方法测定吸光度，重复操作5次，计算多糖吸光度的精密度．

(10)重复性试验．精密称取过二号筛的东北贯众干燥药材粉末0.2g，6份，按1.2(5)项方法制备供试样品溶液，按1.2(7)项方法显色，并于490nm波长处测吸光度．

(11)稳定性试验．精密吸取1.2(5)项制备的东北贯众供试样品溶液1.0mL，按1.2(7)项方法显色，分别于显色后0，10，20，30，40，60，80，100，120min，于490nm波长处测吸光度．RSD=1.05%(n=9)．结果表明，显色后的东北贯众供试样品溶液在2h内稳定．

(12)加样回收率试验．称取已知多糖含量的东北贯众100mg，6份，分别加入1.2(1)项精制东北贯众多糖2mg，按1.2(5)项方法制备样品溶液，并按1.2(7)项方法测定吸光度，计算平均回收率．

(13)样品测定．精密吸取1.2(5)项制备的东北贯众供试样品1.0mL，按1.2(7)项方法显色，并于490nm波长处测吸光度，代入回归方程，计算出多糖中葡萄糖浓度C，再按下式计算多糖含量：多糖含量%=(CDf×100)/W．式中：W为样品质量(mg)；D为样品溶液的稀释因子，f为换算因子．

2 结果与分析

①线性关系.试验结果表明，葡萄糖浓度在0.01～0.06mg/mL的范围内，C与A呈良好线性关系，回归方程为A=7.6849C-0.0067，r=0.9996．②换算因子．测得换算因子f为1.62(n=3)．③精密度试验结果．测得多糖吸光度的精密度RSD为1.01%(n=5)．结果表明该方法精密度良好．④重复性试验结果．测得多糖吸光度的精密度RSD为1.08%(n=6)．结果表明该方法重现性良好．⑤稳定性试验结果．测得多糖吸光度的精密度RSD为1.05%(n=9)．结果表明显色后的东北贯众供试样品溶液在2h内稳定．⑥加样回收率试验结果．测得多糖平均回收率为100.09%，RSD为0.49%(n=6)．⑦样品测定结果．测得东北贯众中多糖的平均含量为2.31%，RSD为0.98%(n=3)．

表1 加样回收率试验(n=6)

3 讨论

本研究采用超声提取技术从东北贯众生药材中提出多糖成分，并参照《中国药典》(2010版)中多糖的含量测定方法，通过苯酚-硫酸法对多糖含量进行测定．研究结果显示，东北贯众中多糖含量约2.31%．东北贯众是常用中药，其功效等同于紫萁贯众，采用开发紫萁贯众有效成分的思路与方法，对东北贯众中多糖类成分进行入研究是十分必要的，而有关其所含多糖化学结构分析及生物活性的研究亟待进行，以利于对东北贯众有效成分的进一步开发利用．

参考文献：

[1]厉博文,张东,杨岚.紫萁贯众中多糖的含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(10):41-43.

[2]南京中医药大学.中药大辞典[M].第2版.上海:上海科学技术出版社,2006.

[3]胡彦武,赵国志,曲迪.东北刺人参茎中多糖的提取及含量测定[J].北方园艺,2011,1(12):161-162.