不同区域小油桐种质差异与ISSR分子标记研究

朱炳耀，杨志敏，庄志鸿，陈 彬，陈 坚

（福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州350003）

不同区域小油桐种质差异与ISSR分子标记研究

朱炳耀，杨志敏，庄志鸿，陈 彬，陈 坚

（福建省农业科学院 生物技术研究所，福建 福州350003）

从台湾、贵州、云南、江西、江苏、湖北、重庆和福建省引进小油桐样品7份，苗木4份，对种子进行形态观察、纵横径测量、百粒重和含油率测试,结果发现：各地收集的种子形态相近，但在种子大小，百粒重，含油率方面各不相同，以云南勐纳种子最大，含油率最高，达59.2%。经ISSR分子标记的聚类分析发现：11个小油桐品种的遗传距离和地理位置没有必然联系; 用5条ISSR引物可以鉴别出至少6种小油桐的种质资源,但分别从江西九江、贵州望谟和湖北咸丰引进的3个商品种（种子）却难以辨别,而分别从福建漳州和云南购买的商品种苗木之间也难以区别。这说明我国不同地域种植的商品种可能出自相近的种源。

小油桐种子；种子形态；种子性状；分子标记

小油桐Jatropha curcas L，又名麻疯树、 小桐子、亮桐、 臭油桐、 绿玉树、 芙蓉树、青桐木、膏桐、 黄肿树、 水漆等， 原产地美洲，在我国云南、四川、广西、贵州、海南、等地有集中种植，在广东、福建、台湾有零星分布[1]。据研究者测定小油桐种子含油率极高，高达40%～ 60%，且富含蛋白质( 约占干重19%～ 27%)[2]；当年种子发芽率高，成苗率高，生长速度快[3]，小油桐与油桐同为大戟科落叶灌木或小乔木，属边际经济林树种，不与粮食作物争地，在原油日益匮乏、环境问题日益严重的今天备受关注，是理想的生产生物柴油的能源植物[4]。其植株喜光、耐干旱贫膺，联合国已经将其作为水土保持植物，列入扶贫的重大项目，广泛用于生态建设加以扶持并获得成功[5]。目前世界上已有20多个国家种植小油桐，用于生产生物柴油[6]，是我国缓解能源危机最有潜在的生物质树种[7]。

我国幅员辽阔，各地生产的小油桐种质资源丰富。由于不同品种的小油桐种子大小，含油率等经济性状各不相同，直接影响小油桐的种植经济效益。为了筛选及推广优质的小油桐种质资源，本研究对从全国各地征集了11份小油桐品种资源，其中分别从台湾、贵州、云南、江西、江苏、湖北和福建省引进的7份为小油桐种子，另外，分别从福建漳州、湖北咸丰、重庆和贵州望漠引进了4份小油桐的苗木；通过比较不同地域小油桐种子形态特征，纵横径测量，百粒重观察和含油率测试；以及对小油桐种质资源进行分子标记技术等研究。从而更好地开发利用小油桐种质资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 小油桐种质资源收集

本课题共收集来自台湾省（T）、云南勐纳(N)、贵州省农科院(G1)、贵州省望谟县(GW)、江苏省沭阳（Y印度种）、江西省九江(J)、湖北省咸丰(H)等地的7个小油桐种子，和来自贵州望漠（1）福建漳州（2）、重庆（3）、云南（4）的4个小油桐种苗，分别进行登记造册。

表1 征集的小油桐基因资源Table 1 Collected genetic resources of Jatropha curcas L

1.2 方 法

1.2.1 小油桐种质的观测

对不同地方收集的小油桐种子用扭力天平称取百粒重、然后拔去种皮，称取种仁重除以种子重量得出出仁率，含油率测定参照《粮食、油料检验-粗脂肪测定方法（GB5582-85）》之索氏提取小油桐种子脂肪并测定含油率。

1.2.2 小油桐种质资源的ISSR分子标记

1.2.2.1 引物及其序列的扩增

用于小油桐ISSR分子标记的引物序列及扩增条带如表2所示。

表2 引物，引物序列和扩增带数Table 2 ISSR primers, sequences and numbers of band amplified

1.2.2.2 DNA 提取与 ISSR 的 PCR 扩增

按照文献[8] 报道的方法提取小油桐基因组总DNA，对100条ISSR引物进行筛选，得到8条条带清晰，重复性好的引物(见表2)。用于本研究。 ISSR扩增体系按文献[9] 方法优化，总体积 25 μL：模板 DNA10 ～ 30 ng、1 UTaq 酶、4 种dNTP 为 2 μL（浓度 215 μmol/L）、10×PCR 的缓冲液 2.15 μL、MgCl21.15 μL、 ISSR引物为2 μL（10 μmol/L）、PCR反应程序：94 ℃预变性5 min，38个循环反应为：94 ℃变性30 s，48 ℃～55℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，最后在72 ℃延伸7 min，4 ℃终止反应10 min。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像仪上观察照相。

1.2.2.3 统计分析

将电泳图上的每1条带定为一个Marker标记，代表了一个结合反应的位点。按胶上的同一个水平位置扩增条带的出现与否进行统计，出现带（包括弱带）的标“1”，不出现的记为“0”，构建二元矩阵，计算Nei氏遗传距离，用非加权的成对算术平均（UPGMA）建立起聚类系统的树状分支图。

2 结果与分析

2.1 小油桐种子形态观测

从不同地区收集的小油桐种子形态上区别不大，但种子大小有一些差异（见图1）。外观上看云南勐腊引进的小油桐种子个体最大，贵州农科院的最小，其余居中。我们分别对不同地域征集的小油桐种子进行纵横径测量，小油桐种子纵径为1.55～1.91 cm，纵径最长的为云南勐腊品种1.91 cm，最小的为贵州农科院收集的1.55 cm；小油桐种子横径为1.01～1.18 cm，横径最大为云南勐腊的1.18 cm，最小的为贵州农科院收集的1.01 cm。

2.2 小油桐种子的百粒重和出仁率测定

我们对不同地域收集的7份小油桐种子进行经济性状测定，结果见表3。从表3中可以看出，小油桐种子百粒重大都在50～60 g之间，云南勐腊百粒重为最高达到80.6 g；出仁率大部分在63～66.5%之间，但征集自台湾的小油桐种子的出仁率最低，为54.2%，这与台湾种由于收集保存日期比较长，加上不是低温保存消耗比较大有关；种仁的干基含油率都在50%以上，以云南勐腊最高达到59.2%。

图1 国内不同地域征集的小油桐种质资源的种子大小比较Fig.1 Comparison of seed size among J. curcas collected from different areas in China

表3 不同收集地小桐子的种子经济性状 (2010年4月8日)Table 3 Seeds economic characters of J. curcas collected from different areas in China

2.3 小油桐ISSR分子标记扩增

近年来，ISSR分子标记已广泛应用于桉树[10]、细叶桉[11]、胡桃楸[12]、地方茶树[13]等林木品种资源的遗传多样性分析，并取得良好的效果。我们用8条ISSR引物对11份征集的小油桐DNA样品进行了PCR扩增, 其中有7份DNA提取自种子中的子叶及胚的样本，而4份提取自叶片样本。在所用的引物中有3条不能扩增出较明显的多态性条带,其中有5条引物可产生具有多态性的条带。如图2所示分别为809号和864号引物对11份植株样本的扩增结果。 前者没有明显的多态性条带，而后者多态性却较高；可以很明显的鉴别出征集至台湾、贵州、重庆的小油桐样品。结果可以发现来自贵州省的3份样品的带型有着明显的不同。

2.4 征集的小油桐样品的聚类分析

对11份从国内各地域征集的样本的ISSRPCR结果的数据进行聚类分析，结果总结在图3中。根据聚类结果可以看出：本文中的11个小油桐品种的遗传距离和征集来源的地理位置没有必然联系。用5条ISSR引物可以鉴别出至少6种不同的小油桐种质资源。但分别从江西九江、贵州望谟和湖北咸丰引进的3个商品种（种子）却难以辨别，而分别从福建漳州和云南购买的商品种苗之间也难以区别。说明我国不同地域种植的商品种可能出自相近的种源。

图2 2条ISSR引物对从全国各地征集的11份小油桐扩增结果的比较Fig.2 Amplification results of 11 samples of J. curcas collected from different areas in China with 2 ISSR primers

3 讨 论

小油桐原产于南美的墨西哥，引入中国境内后半野生或人工栽种于热带与亚热带区域，面积覆盖较广，形成了丰富的资源。从我们目前收集到的7个小油桐种子外观比较来看：形态差别不大，个体差异较大。其中云南勐纳收集的小油桐种子在百粒重，出仁率和含油率方面性状最佳，可以在适宜地区试验推广。从ISSR分子标记图谱看，我国湖北、江西等地引进的小油桐商品种之间差异不大。近年来，我国大批引进海外品种，如江苏引进印度的品种，与国内品种交叉种植，如不加以分子水平鉴别，很难区分开来。文献[14] 对生长在云南不同地域的小油桐的居群进行遗传结构分析时发现：小油桐居群间的遗传距离和它们所在的地理位置距离间的大小没有相关性，从而推测云南小油桐可能引自不同的地区。我们通过研究进一步推测：小油桐最初可能由国外不同的产地引入我国各省市地区进行种植, 这样即会导致地理位置相差很大的两个地区的居群亲缘关系反而很近，如江苏或其他省均引进印度种；同时，也会造成同一省域不同地区的居群亲缘关系反而很远，如我们从贵州省不同单位引种的小油桐之间差异反而大于从不同省份引种的小油桐之间的差异也就有了比较合理的解释。

图3 5条ISSR引物对全国各地征集的11份小油桐DNA扩增结果的聚类分析Fig. 3 Cluster of amplification of 11 samples of J. curcas collected from different areas in China with 5 ISSR primers

根据国内外报道,小油桐是极具潜在的能源和经济作物。利用它可以开发产生生物柴油[15]、中药研制、病虫害生物防治、水土保持、高级环保型油漆、涂料和防腐剂等有多领域应用前景[6-7]。本研究通过对全国各地征集的小油桐11个种质资源ISSR标记的分析，将11个种质资源进行了初步的区分。这为今后的从事小油桐品种选育工作打下了一定的基础，可以从中选择较远亲缘关系的小油桐品种作为参试的种，通过示范种植比较或用于育种亲本以增大其后代的遗传变异性，以达到最大限度地改良小油桐品种性状的目的。此外，还希望进行更多的分析测试，针对不同区域和产地小油桐品种表现出不同的生育生长特征与种子的理化特性,对各区域和产地的小油桐品种种质资源进行划分，把它分为高油、高产、高效、高毒等不同特性的小油桐品种,用于生产生物柴油、病虫害生物防治、水土保持、环保型化工用油漆等不同用途的优良品种。

参与文献：

[1] 中国植物志编委会.中国植物志（第四十四卷，第二分册）[M]. 北京: 科学出版社，1996:147-148.

[2] Openshaw K. A review of Jatropha curcas: an oil Plant of unidentifiied promise[J]. Biomass and Bioenergy, 2000，19(1):1-15.

[3] 朱炳耀,林丛发,杨志敏,等.小油桐育苗技术研究[J].安徽农业科学，2011，39(21)：12931-12932

[4] 张玲玲，彭俊华.油桐资源价值及其开发利用前景[J].经济林研究，2011，29(2)：130-135

[5] 何文淑,肖荣贵,杨晓琼,等.麻疯树在贫困地区农村发展和生态建设中的开发前景[J].中国中医药信息杂志,2002,9(10):33-36.

[6] 王兆玉,林敬明,徐 增,等.小油桐生物活性成分与药用价值研究进展[J].中药材，2007，30(10):1332-1335.

[7] 谭晓风，将桂雄，谭方友,等.我国油桐产业化发展战略研究调查报告[J]. 经济林研究，2011，29（3）：1-7.

[8] 欧文军, 李开绵, 王文泉,等.小桐子基因组DNA 的提取及ISSR- PCR 反应体系的优化[J]. 中国农学通报,2008，24(5)：409-413.

[9] 王桂娟, 陈茂盛, 向振勇,等.小桐子ISSR-PCR 体系的优化[J]. 生物技术通报, 2008,3: 162-165.

[10] 张党权, 田 华, 谢耀坚, 等.桉树4个种遗传多样性的ISSR分析[J].中南林业科技大学学报，2010，30(1)：12-17.

[11] 张党权，田 华 ，谢耀坚，等，细叶桉遗传多样性的I S S R分析[J]. 中南林业科技大学学报，2009，29(5)：91-94.

[12] 王东娜, 牟长城,高 卓,等.胡桃楸天然种群遗传多样性的ISSR分析[J].经济林研究，2011,29(2):22-29.

[13] 吴 田,沈晓进,李法营,等.双江古茶树与云南大叶种茶群体品种间的ISSR分析[J].中南林业科技大学学报,2012,32(3): 136-140.

[14] 向振勇,宋松泉,王桂娟,等.云南南部不同种源地小桐子遗传多样性的ISSR 分析[J].云南植物研究,2007,29(6):619- 624.

[15] 文 彬.小油桐籽油生产生物柴油的经济性探讨[J].炼油技术与工程, 2007,18(7):47-49.

Study on character differences of Jatropha curcas L seeds from different region in China and analysis with ISSR molecular marker

ZHU Bing-yao, YANG Zhi-min, ZHUANG Zhi-hong, CHEN Bin, CHEN Jian

(Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, Fujian, China)

Seven samples of seeds and 4 samples of seedlings of Jatropha curcas L were collected from different provinces of China including Taiwan, Guizhou, Yunnan, Jiangxi, Jiangsu, Hubei and Fujian. The appearances of seeds were observed and the diameter of seed, mass of 100 seeds, oil content in the seeds were measured; the seeds from Yunnan Mengman were the biggest in size, theirs oil yield reached the hightest,being 59.2%. The results of cluster analysis by ISSR molecular marker indicate that there was not necessarily linkage between genetic distance and geographical position of the 11 J. curcas seeds and seedlings; At least 6 samples of J. curcas could be differentiated with 5 primers of ISSR,however, the 3 samples of commercial seeds collected from Jiujiang Jiangxi, Wanmo Guizhou and Xiangfen Hubei could not been identified;Besides the two commercial seedlings purchased from Zhangzhou of Fujian, Yunnan could also not been identified. It is shown that the commercial cultivars of J. curcas in different regions of China probably originated from the similar provenance.

Jatropha curcas L; seed morphology; seed character; molecular marker

S794

A

1673-923X(2013)04-0013-04

2012-10-16

福建省科技厅重点课题(项目编号：200901010014)；福建省农业科学院科技下乡“双百”行动项目(项目编号：sbmb1250)

朱炳耀(1962-)，男，福建闽侯人，副研究员，主要从事植物基因资源收集与利用开发研究；E-mail:zhubinyao@sohu.com

陈 坚(1965-)，男，福建永泰人，研究员，从事植物基因资源评价及利用研究；E-mail：cjform2005@yahoo.com.cn

[本文编校：欧阳钦]