金银花不同品种间遗传变异的ISSR分析

王湘莹，何 钢，王晓明，乔中全

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

金银花不同品种间遗传变异的ISSR分析

王湘莹1，何 钢1，王晓明2，乔中全2

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

采用ISSR标记技术对金银花不同品种的遗传变异进行了研究。从100个引物中筛选出10个重复性高、扩增效果好的引物，对23个金银花品种的样本进行PCR扩增，共获得174条稳定的谱带，其中多态性条带169条，多态性比率为97.1%，23个金银花品种间的遗传相似系数范围在0.471 3～0.100 0之间，平均遗传相似数为0.629 9，平均基因多样度(He)和Shannon多样性指数分别是0.379 3和0.556 3，表明品种间的遗传基础较宽及遗传多样性较高。聚类分析(UPGMA)表明：23个供试金银花品种划分为忍冬、美国忍冬、灰毡毛忍冬3大类。可见，利用 ISSR标记可有效地分析金银花种质资源的遗传变异，为金银花品种鉴别、分类、种质资源的有效利用提供理论依据。

金银花；遗传变异；亲缘关系；ISSR分析

金银花Lonicera japonica，忍冬科CaPrifoliaeeae忍冬属Lonicera植物，又名双花，主要包括灰毡毛忍冬、忍冬、红腺忍冬、毛花柱忍冬、山银花等，是我国传统名贵中药材，具有保肝、消炎、抗衰老、抗病毒、清热解毒等生物学活性作用[1-3]，已被广泛应用于制药、化妆品、香料、饮料、保健品等领域[4]。我国的金银花地方品种资源非常丰富，但优良品种很少，各个地方种植的金银花品种混杂，良莠不齐，同物异名、同名异物的现象在各地都有出现[5]，严重影响金银花新品种的推广及整个产业的良性发展，同时也制约了金银花良种选育的进程。因此，研究金银花品种间遗传变异对金银花的品种鉴定、品种改良、生产实践和引种等均具有重要意义。DNA分子标记已经广泛应用于动植物和微生物的遗传多样性研究，它从分子水平进行生物遗传多样性分析[6]。国内外有关于利用RAPD分子标记与同工酶、DNA序列分析进行金银花种质鉴 定[7-8]的报道，也有利用PCR技术对细毡毛忍冬、金银花和山银花的5S-rRNA基因间区进行扩增和测序，研究道地与非道地药材之间的遗传距离[9]。但是，目前较少有人利用ISSR分子标记技术进行金银花遗传变异分析。ISSR分子标记技术克服了RAPD和RFLP两种标记技术的局限性[10-11]，具有多态性高、操作简单、稳定性高、重复性好及成本低等特点，可以检测出丰富的遗传多样性。本研究利用ISSR技术对23份金银花品种进行标记，分析了金银花品种间及花瑶晚熟新品种组培过程的遗传变异，建立了金银花不同品种的DNA指纹图谱，为金银花品种鉴定、种质资源的保存和利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验材料是23个金银花品种的新鲜叶片（见表1），所有供试材料均采自湖南省林业科学院金银花种质资源收集圃。采集后的新鲜叶片置于液氮中保存带回，并将其保存在-80℃冰箱中备用。

表1 23份金银花资源的名称及来源Table 1 Names and origins of 23 Lonicera japonica used in this study

1.2 基因组 DNA 的提取

基因组DNA的提取按照北京天根生物有限公司的植物DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）的说明书进行。

1.3 ISSR 引物退火温度及多态性筛选

试验所用引物参照加拿大哥伦比亚大学（University of British Columbia Biotechnology,UBC）公布的植物通用ISSR引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。从100条引物中筛选出扩增条带清晰、多态性好的10条引物（见表2）。参考不同引物的Tm值，采用梯度PCR确定相应的退火温度，以‘花瑶晚熟’原种、‘金翠蕾’2个品种为模板，分别在45～65 ℃之间设置12个梯度温度，通过1.2%琼脂糖凝胶检测，以扩增带型清楚、多态性好且杂带较少的温度作为该引物的退火温度。

表2 ISSR引物名称及序列Table 2 Names, sequences of ISSR primers

1.4 ISSR-PCR 扩增

参照已有的ISSR-PCR 体系[12]，采用个人 型 普 通 PCR仪（eppendorf、Mastercycler Personal）。20 μL 反 应 体 系：1×PCR buffer（Mg2+free），1.5 U TaqDNA聚合酶，0.15 mmol/L dNTPs，0.4 μmol/L 引 物，1.5 mmol/L MgCl2，60 ng模板DNA。PCR扩增程序为94℃ 5 min； 94℃30 s，48～56℃（不同引物有其特异退火温度）30 s，72℃ 1.5 min， 35个循环；72℃10 min；4℃保存。ISSR-PCR 产物在1×TAE 缓冲液中，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电压设定为90 V，电泳35 min。EB染色，G：box EF2凝胶成像仪拍照记录。所有实验重复2次以上。

1.5 数据处理与分析

将ISSR扩增产物每个条带看作1个等位基因。清晰度高、重复性好、分辨率高的条带用于分析，按条带的有或 无分别记为1或0，即有条 带记为1，无条带记为0，建立原始数据矩阵。用Popgene32分析软件计算不同品种间的基因多样度、Shannon信息指数等。用NTsys2.10分析软件进行遗传相似系数分析，采用Nei 氏[13]计算各个材料间的遗传相似系数I（I=2mxy/mx+my，其中mxy为第x个材料和第y个材料共有的条带数，mx和my分别为第x个材料和第y个材料各自的总扩增带数）和遗传距离D（D=1-I），并用UPGMA法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR多态性

在金银花23个样本中，10个ISSR引物共扩增出174条清晰、重复性好、分比率高的条带，分子量为200～2 000 bp（见表3，图1）。其中169条为多态性条带，不同引物扩增条带数12～22条不等，平均每个引物扩增出17.4条带，平均每个ISSR引物可获得16.9条多态谱带，多态性比率（PPB）为97.1%。

表3 ISSR引物扩增结果及多态性Table 3 Amplification results and polymorphism of intersimple sequence repeat (ISSR) primers used in this study

图1 UBC836 扩增结果Fig.1 Amplified result of primer UBC836

2.2 金银花品种间遗传多样性

遗传多样度和香农（shannon）信息指数是衡量生物遗传多样性的两个重要指标，根据ISSR引物所揭示的多态性，计算得到金银花品种间遗传多样性情况（见表4），品种间平均基因多样度（He）和shannon多样性指数分别是0.379 3和0.556 3，表明金银花品种间遗传多样性较高，存在丰富的遗传变异，这与从表型性状层次的分析是一致的。

2.3 遗传相似性分析与聚类分析

根据ISSR引物扩增出的条带，按照Nei’s公式，计算23个金银花品种间的遗传相似系数（见表5）。23个家系间遗传相似系数值变化范围是0.471 3～0.100 0，平均遗传相似性系数为0.629 9，表明品种间的遗传基础较宽及遗传多样性较高。其中，‘银翠蕾’与‘龙花’两品种间的遗传相似数为0.856 3，亲缘关系较进；‘Americana’与‘抗7 ’遗传相似度为0.471 3，亲缘关系最远。‘花瑶晚熟’原种与‘花瑶晚熟1号’（继代10次组培苗）、‘花瑶晚熟2号’（继代20次组培苗）遗传相似度为1.000 0，表明‘花瑶晚熟’原种与‘花瑶晚熟’组培苗没有发生遗传变异，组织培养继代次数达到20次时没有发生遗传变异，至于继代次数20次以后有没发生变异及什么时候发生变异还需做进一步的研究。

表4 23个金银花品种的遗传多样性评估Table 4 Genetic diversities estimation for 23 Lonicerajaponica species

表5 金银花品种间的遗传相似系数Table 5 Genetic similarity coefficients of 23 honeysuckle cultivars

根据品种间的遗传相似系数，按UPGMA法进行聚类分析，从聚类图（见图2）可以看出，利用ISSR分子标记，在相似性系数为0.56时，可将23品种分为3个大的类群，第一类包括‘金丰1号’、‘九丰1号’、‘Honcsyrose’、‘Etrusca Superba’4个品种，为忍冬种群，每个花梗上只有2个花管，花管绒毛较多，绿色；第二类包括‘Blanche Sandman’、‘Americana’2个品种，为美国忍冬种群，每个花梗上只有2个花管，花管绒毛较多，红色；第三类包括‘抗5’、‘抗6’、‘抗7’、‘抗8’、‘抗9’、‘抗10’、‘龙花’、‘龙2号’、‘龙3号’、‘龙9号’、‘白云’、‘湘蕾’、‘金翠蕾’、‘银翠蕾’、‘花瑶晚熟’、‘花瑶晚熟1号’、‘花瑶晚熟2号’17个品种，为灰毡毛忍冬种群，花梗上簇生多个花管（10个以上），花管表面光洁，无毛。聚类结果能充分说明品种间的亲缘关系。

图2 金银花品种资源ISSR分子聚类分析Fig.2 Dendrogram of UPGMA cluster f or 23 honeysuckle cultivars based on ISSR Markers

3 结 论

ISSR分子标记能灵敏地揭示两个亲缘关系十分相近个体间的差异[13]，同时因为ISSR引物较长（16～25 bp），使PCR扩增退火温度较高，扩增结果重复性好[14-15]，已被广泛应用于各个研究领域，特别是在辅助育种方面。另外，ISSR标记技术检测金银花种质资源多样性研究结果证明它是一种非常有效的工具[16]。

本研究用10条ISSR引物对23份金银花品种资源的遗传多样性进行分析，共扩增出174条清晰、重复性好的普带，169条具有多态性，多态性比率为97.1%，这表明金银花种质资源拥有丰富的遗传多样性。同时也建立了金银花不同品种的DNA指纹图谱，为金银花品种鉴定、种质资源的保存和利用提供理论依据。

另外，本研究利用ISSR分子标记技术对‘花瑶晚熟’新品种组织培养过程中遗传稳定性进行了研究，‘花瑶晚熟’原种与‘花瑶晚熟1号’（继代10次组培苗）、‘花瑶晚熟2号’（继代20次组培苗）遗传相似度为1.000 0，表明‘花瑶晚熟’原种与‘花瑶晚熟’组培苗没有发生遗传变异，组织培养继代次数达到20次时没有发生遗传变异，至于继代次数20次以后有没发生变异及什么时候发生变异还需做进一步的研究。因此，ISSR分子标记可以从分子水平为金银花新品种的组织培养提供理论指导依据。

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ISSR analysis on genetic variations among different varieties of Lonicera japonica

WANG Xiang-ying1, HE Gang1, WANG Xiao-ming2, QIAO Zhong-quan2

(1. School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Forestry Academy, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ The genetic variation of different varieties of Lonicera japonica was analyzed by inter-simple sequence repeats (ISSR). Ten ISSR primers with high polymorphic and clear bands were filtered and utilized for testing the genetic variance of 23 Lonicera japonica varieties. The results demonstrate that 174 DNA fragments were amplified, among which 169 DNA bands were polymorphic with the ratio of polymorphism 97.1%, 23 genetic similarity coefficients ranged from 0.471 3 to 0.862 1, with an average of 0.629 9; Nei’s gene diversity (He) and Shannon’s information index were 0.379 3 and 0.556 3 at the species level respectively, which proved that the Lonicera japonica varieties had a wide genetic base and a high genetic diversity; The cluster analysis presented that the 23 varieties were divided into three main groups by using the unweighted pair-group method with arithmetic average (UPGMA) based on ISSR molecular marker data. So, the ISSR markers can be effectively used to evaluate the genetic diversity of honeysuckles, thus providing a theoretical foundation for the identification and classification of honeysuckle cultivars, and for the efficient use of their germplasm resources.

∶ Lonicera japonica; genetic variation; genetic relationship; ISSR analysis

S759.3；Q948

A

1673-923X(2013)11-0077-06

2013-05-10

国家公益性行业科研专项“金银花、厚朴优良新品种创制及利用技术研究”（201104023）

王湘莹（1989-），女，湖南长沙人，研究生，主要从事植物分子生物学研究

何 钢（1965-），男，湖南湘潭人，教授，硕士，从事生物技术教学与科研

[本文编校：谢荣秀]