rAAV－hBMP7的包装纯化及感染滴度的测定※

西安交通大学口腔医院 （西安710004） 石建峰 饶国洲 魏 虹 张 晨 李 昂

骨形成蛋白（BMPs）是一类具有多种功能的生长因子，属于转化生长因子β超家族，具有明显促成骨作用的细胞因子，参与机体胚胎发育、骨骼形成及组织器官发生等生命过程。人骨形成蛋白7（Human bone morphogenetic protein－7，hBMP7）是其中促成骨作用较强的一个成员，具有较强的骨诱导能力及维持软骨细胞的表型、促进细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成、促进有成骨作用的细胞分化等能力，在体内外均能诱导形成骨组织、牙本质，不仅可实现牙槽骨的再生，还可明显提高牙骨质再生量，是组织工程技术常用的一种细胞因子［1］。

基因转移载体的选择，决定着治疗基因能否进入种子细胞并实现有效表达，是基因治疗和组织工程技术的关键环节。重组腺相关病毒［2］（Recombinant adeno－associated virus carrierr，rAAV）宿主范围广，既能感染分裂期细胞也能感染非分裂期细胞；能将其基因组DNA定点整合到宿主细胞染色体上，使携带的外源基因在宿主体内持续稳定表达，且不引起宿主基因突变。以rAAV为基础构建的病毒载体，已经在科学研究领域及多种疾病的基因治疗方面得到了广泛的应用。

本组拟利用前期构建并鉴定正确的腺相关病毒载体pAAVIRES－hrGFP－hBMP7［3］，应用 AAV Helper－Free System、磷酸钙三质粒共沉淀法，在AAV－293细胞内包装具有感染性的腺相关病毒rAAV－hBMP7，按氯仿处理、PEG／NaCL沉淀的方法浓缩纯化；并测定其包装效率及感染AAV－HT1080细胞后的感染效率和滴度，为组织工程技术治疗牙周组织缺损做基础性研究。

材料与方法

1 试验材料 AAV Helper－Free System、AAV－293细胞、AAV－HT1080细胞、pAAV－GFP质粒、胎牛血清、L－DMEM 培养基、H－DMEM 培养基购自美国Stratagene公司；高纯度质粒大提试剂盒购自北京TIANGEN公司；磷酸钙法细胞转染试剂盒、β－半乳糖苷酶原位染色试剂盒购自碧云天（Beyotime）公司；氨苄青霉素、链霉素购自北京奥科；其余试剂为国产分析纯。

2 实验方法

2．1 质粒转化 制备含 Amp（50μg／m1）的LB固体平板，流水下快速解冻DH5α感受态细胞，加入1 μl pAAVIRES－hrGFP－hBMP7质粒，轻轻旋转混匀，冰浴30min；42℃热休克90s；冰浴2min，加入预热至37℃的LB液体培养基400μl，37℃，摇床转速＜50r／min温育45min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性基因；取100μl菌液涂于含X－gal和IPTG的琼脂平皿，于37℃培养16～18h；终止培养后，将平板置4℃冰箱1～4h，使蓝白斑筛选实验充分显色。同法对辅助质粒pAAV－Helper和包装质粒pAAV－RC进行转化。

2．2 质粒大量提取及浓度和纯度测定 每种质粒随机挑取3个转化阳性克隆（白色克隆），各加入到5 ml LB液体培养基中（含 Amp 50μg／ml），37℃、225 r／min震荡培养3h，分别加入到装有250ml LB液体培养基（含 Amp 50μg／ml）的500ml三角烧瓶中，37℃、225r／min震荡培养过夜，测A600处OD值＞0．60，质粒大提试剂盒提取质粒，进行浓度和纯度测定。用BamHI／SalI双酶切鉴定重组病毒质粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7。

2．3 AAV－293细胞培养 在37℃水浴中快速解冻AAV－293细胞，将细胞悬液转移到装有10mlDMEM培养液的锥底离心管中，室温下以200g的速度离心3min吸除上清液，重新加入5ml新鲜DMEM轻轻吹打重悬细胞，转移到一个装有10mlDMEM（氨苄青霉素100U／ml和链霉素100μg／ml）的75cm的组织培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至50%融合时传代培养。

2．4 三质粒共沉淀法AAV－293细胞包装rAAV－hBMP7 将AAV－293细胞种植于6孔培养板内，3×105／孔，培养至70～80%融合。采用AAV Helper－Free System／磷酸钙三质粒共沉淀法转染AAV－293细胞（以下为每孔加液量）。转染前30～60min，吸去培养液，加入新鲜的不含抗生素的DMEM完全培养液4ml。分别取纯度1．80以上的pAAV－Helper、pAAVIRES－hrGFP－hBMP7 和 pAAV－RC 各 10μl（1μg／μl），加入到 100μl氯化钙溶液中混匀，对照组以pAAV－GFP代替病毒质粒。把DNA－氯化钙溶液加入到100μl BBS溶液中混匀，室温孵育20min均匀滴加到整个孔内。实验组10孔，对照组1孔，阴性对照1孔／板。37℃，5%CO2的培养箱中培养。12h后轻轻晃动培养板数次，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入2ml新鲜的完全培养液继续培养72h，收集细胞，期间倒置显微镜下观察细胞形态及荧光表达情况。

病毒包装完成后，取平行对照rAAV－GFP组细胞培养皿，倒置荧光显微镜下随机选取高倍视野下（400×）10个视野，计数视野内表达荧光细胞数量及细胞总数计算rAAV－hBMP7的包装效率。

2．5 病毒液的收集和纯化 用细胞刮刀把贴壁细胞全部刮落到培养液中，转移到一消毒、预冷的50ml离心管中，反复冻融四次（干冰浴和37℃水浴），每次冻和融的时间为10min左右。每次融化后轻轻漩涡振荡离心管。12000r／min离心10min除去细胞碎片。将含病毒的上清转入一新的试管中。

向病毒液中（40ml）加入1／10体积的氯仿，37℃，300rpm／min剧烈振摇1h。加入固体氯化钠2．56g至终浓度为1mol／L，4℃、12000r／min离心30min，收集上清于一新的50ml离心管中，加入PEG8000 4．5g至终浓度10%，剧烈振摇直至完全溶解，冰浴1h。4℃，12000r／min离心30min弃上清，4ml PBS溶解沉淀，以每份0．5ml分装在1．5ml EP管中，–80℃保存。命名为rAAV hBMP7。

2．6 rAAV hBMP7感染 AAV－HT1080细胞将AAV－HT1080细胞复苏及传代培养（方法和步骤同AAV－293细胞的复苏与传代）。用L－DMEM调节细胞密度为1．5×105／ml，种植于12孔培养板，每孔1ml，37℃培养至70%融合。每孔加0．2ml AAV Permissive Growth Medium，（保留最初的培养液），漩涡振荡混合细胞，37℃孵育5～6h 吸除孔内液体，用37℃预温的L－DMEM 洗涤细胞1次。用L－DMEM将纯化的病毒原液0．1ml按10×的浓度梯度稀释为10－2，10－3，10－4，10－5，10－6。分别加入各培养孔，每浓度组设3孔，每孔0．5ml，在37℃孵育培养板2h，其间每30min轻轻漩涡振荡培养板几次。各加0．5ml预温的H－DMEM，继续培养48h。期间倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态结构及荧光表达情况。

2．7 β－半乳糖苷酶染色法测定rAAV hBMP7感染效率和滴度 AAV－HT1080细胞培养至48h，吸出培养液，用L－DMEM洗涤细胞一次，原位β－半乳糖苷酶染色试剂盒固定并染色细胞。每孔加0．5mlβ－半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10min；吸除固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min；每孔加入0．5ml染色工作液（10μlβ－半乳糖苷酶染色液 A ＋10μlβ－半乳糖苷酶染色液B＋930μlβ－半乳糖苷酶染色液C＋X－Gal溶液50μl）；37℃孵育20min至2h，直至部分细胞颜色变蓝。显微镜下观察并计数一定细胞中蓝色细胞的个数，计算rAAV hBMP7感染效率，感染效率＝染色阳性细胞数／计数细胞总数×100%，并估算病毒原液感染滴度。

结 果

1 质粒浓度和纯度 提取的pAAVIRES－hrGFP－hBMP7质粒，经紫外分光光度仪检测，在260nm处OD值为0．56，OD260／OD280＝1．79；OD260值为1．0相当于大约50μg／ml双链DNA，质粒稀释倍数为40，计算得质粒浓度为1．12mg／ml（1．12μg／μl）。同法计算包装质粒pAAV－RC的浓度为1．08μg／μl，纯度为1．81；辅助质粒pAAV－Helper浓度为1．22μg／μl，纯度为1．82，纯度和浓度均符合后继实验要求。

2 pAAVIRES－hrGFP－hBMP7双 酶切 鉴 定 用BamHI／SalI双酶切重组病毒质粒pAAVIRES－hrG FP－hBMP71．2%琼脂糖凝胶电泳图谱显示6100bp和1300bp区域有两条DNA条带（见图1），与病毒载体 质 粒 pAAVIRES－hrGFP（6．1Kb）及 目 的 基 因hBMP7（1296bp）大小一致。双酶切图谱说明所提质粒为前期构建并鉴定的质粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7。

3 rAAV hBMP7在293细胞内的包装

3．1 包装6h细胞形态结构和荧光表达情况 病毒包装6h后，倒置显微镜低倍下观察可见rAAVGFP组、rAAV－hBMP7组AAV－293细胞形态正常、生长状态良好。提示磷酸钙共沉淀物对AAV－293细胞生长干扰较小，底部可见少量细小的颗粒，为残余的磷酸钙共沉淀物；高倍镜下观察AAV－293可见细胞浆中含有较多极细小的磷酸钙颗粒（见图2）。倒置荧光显微镜观察，阴性组无荧光，rAAV－GFP组和rAAV－hBMP7组均出现荧光表达，以对照rAAV－GFP组为明显（见图3）。提示病毒在293细胞内已经获得“拯救”、包装，并随细胞的分裂而复制，报告基因也已经开始表达。

图1 质粒pAAVIRES－hrGFP－hBMP7双酶切图M：DNA MakerⅥ，1：BamHI／SalI 双酶切

图2 包装6h后AAV－GFP组倒置显微镜下AAV－293细胞表型变化（A：100×；B：400×）

图3 包装12h后AAV－GFP组荧光表达（A：普通倒置显微镜；B：倒置荧光显微镜；400×）

3．2 包装72h观察 阴性组始终无荧光发出（图4A，D），随培养时间延长，rAAV－GFP组（见图4 B，E）和rAAV－hBMP7（见图4C，F）组培养基颜色逐渐变为棕黄色，板底细胞表面有沉淀物形成，上清中也有大量絮状物出现，细胞形态变的不规则，有相互融合的趋势。两组细胞表达荧光的细胞数量及荧光强度也随包装时间延长而增加，72h时绝大多数细胞都发荧光。各组细胞同一视野下形态结构及荧光表达情况见图4。

3．3 包装效率 病毒包装完成后，取平行对照rAAV－GFP组细胞培养皿，倒置荧光显微镜下随机选取高倍视野下（400×）10个视野，计数视野内表达荧光细胞数量及细胞总数，取平均值计算rAAV－hBMP7包装效率为94．16±0．13%。

图4 包装72h倒置显微镜下AAV－293细胞表型变化及倒置荧光显微镜下GFP表达

4 rAAV－hBMP7感染AAV－HT1080细胞荧光表达 纯化的rAAV－hBMP7各浓度组感染AAVHT1080细胞后，12h左右均有表达绿色荧光的细胞出现。随着培养时间的延长，高浓度组细胞从培养板底面脱离，细胞结构破坏，相互融合，荧光表达也融合成片，继续培养则荧光表达下降；低浓度组细胞界限清晰，结构较正常，细胞损伤轻微，荧光表达清晰持久（见图5），6～7d达到高峰。

5 原位β－半乳糖苷酶染色法测定rAAV hBMP7感染效率和病毒滴度 rAAV－hBMP7转染易感细胞AAV－HT1080后，病毒复制，病毒载体上的β－半乳糖苷酶基因表达，催化底物X－Gal显色，细胞被蓝染。选择细胞形态保持较完整、数量适中（10＜n＜100）的浓度组，光学显微镜下计数10不同视野中的蓝染细胞数，计算转染效率：镜下观察发现10－5，10－6两个组细胞形态完整（见图6A），界限清晰；其他组别细胞形态损伤严重，细胞边缘模糊、破裂相互融合（见图6B），提示病毒颗粒过多，细胞发生毒性改变。计算转染效率10－5组约为78%；10－6组约为35%。参照细胞形态变化情况可以确定，实验获得的rAAV－hBMP7作10－5稀释可以获得78%的较好转染效率；以该组别转染效率推算病毒感染滴度：种植细胞数／ml×感染效率×病毒实际稀释倍数（1／稀释用量0．1ml÷稀释后浓度值10－5÷每孔病毒用量0．5ml），rAAV hBMP7的滴度约为2．34×1011v·g／ml，可用于后继实验。

图5 rAAV－hBMP7（10－5 组）感染 AAV－HT1080细胞72h后荧光表达（A：倒置显微镜；B：倒置荧光显微镜；×100）

图6 原位β－半乳糖苷酶染色结果（200×）

讨 论

骨形成蛋白（BMPs）存在于骨、牙本质等多种组织中，对骨组织的发育和修复重建起着关键性作用，BMP7是BMPs家族中促成骨能力最强的生长因子之一［4］。研究发现BMP7诱导新骨形成，一般是通过三步多分子级联放大反应来产生成骨效应［5］。①诱导细胞趋化，促进特定的细胞群发生方向性趋化，进而诱导细胞黏附和增殖；②诱导和促进有丝分裂；③诱导细胞分化，BMP－7能够诱导多种细胞向成骨型细胞分化，促进细胞基质合成，I型、II型胶原、ALP、骨钙素等的基因表达升高。

在口腔领域，许多学者尝试将BMP7或BMP7复合其它因子用于牙周组织工程中，刺激牙周膜中的潜在细胞群分化增殖，促进牙周和颌面部组织缺损的修复与重建。Jin等［6］利用BMP－7基因修饰的皮肤成纤维细胞，附合凝胶载体支架，修复小鼠下颌牙槽骨缺损的实验发现，转染组小鼠在骨缺损部位有软骨的快速形成，继而形成骨及牙骨质。Yeh［7］等的研究发现，BMP7能促进分化的成骨细胞高表达骨钙素及碱性磷酸酶，诱导形成钙化结节，细胞成骨活性增强。证实了rhBMP－7的促成骨特性。本课题应用前期构建并鉴定的pAAVIRES－hrGFP－hBMP7质粒，制备有感染性的rAAV病毒，以期获得hBMP7在真核细胞内的表达，为牙周组织缺损的治疗做基础性研究。

腺相关病毒载体具有能在人类染色体定点整合、长期稳定表达而无致癌隐患，转染效率高而免疫原性低等优点，是近年来研究和应用最广的一种病毒类载体［8］。Kunze等［9］比较了1～5型AAV 对牙周膜细胞、牙龈细胞感染效率的差别后发现，各型的转染效率存在差别，以AAV2最高，AAV4最低，其它三型介于这俩型之间。rAAV病毒的包装，主要涉及包装容量、包装体系和病毒纯化几个方面。包装容量小是rAAV载体最大的缺陷，仅为5kb左右，很多情况下不能满足基因治疗的需要，如何增加rAAV载体的包装容量成为扩大其应用的热点课题［10］。本组采用的pAAVIRES－hrGFP质粒，仅保留了AAV包装和整合不可缺少的ITRs，不仅增加了包装容量，在两个ITRs之间还有一核糖体基因IRES，可以实现双基因共表达，又能促使AAV的核内定位。

rAAV传统的包装体系不仅步骤繁琐，而且存在AV的污染难以完全去除。本组采用的AAV Helper－Free System，就是对其不断改造的基础上建立的比较完善的包装体系［11］。其中的pAAV－RC表达AAVCap和Rep蛋白；pHelper含有与AAV包装有关的腺病毒基因E4、E2a和VA RNA；E1a和E1b则由293包装细胞提供；该系统不仅简化了操作、提高了产量，而且避免了野生型AAV和AV的污染。本实验应用该系统包装6h时，各组都出现荧光表达，说明该系统病毒“拯救”很快，而且细胞形态正常、生长状态良好。

病毒纯化的目的是去除可能的AV和野生型AAV污染，及可复制性AAV（rcAAV）杂质（含有非目的基因DNA序列的类AAV颗粒）［12］。传统的方法是硫酸铵浓缩、氯化铯密度梯度离心，操作繁琐，病毒液损失太多［13］。近年来，吴小兵等［14］提出的氯仿处理－PEG／NaCl沉淀－氯仿反复抽提的方法，对rAAV病毒原液进行浓缩和纯化，效果较为满意。

病毒感染效率和滴度的测定，许多研究者［15］应用AAV易感细胞（HT1080）表达荧光的细胞数（或百分比）来进行估算，简便易行，但是计数结果容易受培养基底色和荧光折射的影响，估算结果有较大偏差。本组采用原位β－半乳糖苷酶染色，计数蓝染细胞个数，细胞间干扰小，而且能观察病毒颗粒对细胞形态的影响情况。

本组应用磷酸钙三质粒共沉淀法，成功制备了rAAV－hBMP7，通过对照组AAV－GFP表达荧光的细胞数量，测定包装效率为94．16±0．13%。原位β－半乳糖苷酶染色估算rAAVhBMP7病毒原液的感染滴度为2．34×1011v．g／ml。可用于后继实验的细胞转染。

［1］ Wozney JM．Overview of bone morphogenetic proteins［J］．Spine（Phila Pa 1976），2002，27（16Suppl 1）：2－8．

［2］ St George JA．Gene therapy progress and prospects adenoviral vectors［R］．GeneTher，2003，10（14）：1135－1137．

［3］ 石建峰，李 昂，饶国洲，等．hBMP－7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究［J］．陕西医学杂志，2008，37（1）：73－75．

［4］ Schlance T，Andree B，Arfnold H H，et al．BMP－2is required for early hears development during a distinct time period［J］．Mech Dev，2000，91（1－2）：259－270．

［5］ Yamazoe T，Aoki K，Simokawa H，et al．Gene expression of bone matrix proteins in a calcified tissue appeared in subcutaneously transplanted rat dental pulp［J］．J Med Dent Sci，2002，49（1）：57－66．

［6］ Jin QM，Anusaksathion O，Webb SA，et al．Gene therapy of bone morphogenetic protein for periodontal tissue engineering［J］．J Periodontol，2003，74（2）：202－213．

［7］ Yeh LC，Lee JC．Co－transfection with the osteogenic protein（OP）－1gene and the insulin－like growth factor（IGF）－1gene enhanced osteoblastic cell differentiation［J］．Biochim Biophys Acta，2006，1763（1）：57－63．

［8］ McCarty D M．Self－complementary AAV vectors；Advances and applications［J］．Mole Ther，2008，16（10）：1648－1656．

［9］ Kunze M，Huber A，Krajewski A，et al．Efficient gene transfer to periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts by adenoassociated virus vectors［J］．J Dent，2009，37（7）：502－508．

［10］ Bainbridge J W，Smith A J，Barker S S，et al．Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis［J］．N Engl J Med，2008，358（3）：2231－2239．

［11］ Xiao X，Li J，Samulski RJ．Production of high－titer recombinant adeno－associated virus vectors in the absence of helper adenovirus［J］．J Virol，1998，72（4）：2224－2232．

［12］ 刁 勇，王启钊，肖卫东，等．重组腺相关病毒载体相关性杂质［J］．生物工程学报，2011，27（5）：717－723．

［13］ Dracopoli N．Current protocols in human genetics［M］．New York：John Wiley，1996：257－336．

［14］ 吴小兵，董小岩，伍志坚，等．一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法［J］．科学通报，2000，45（19）：2071－2075．

［15］ 时志斌，强 辉，樊立宏，等．重组人骨形态发生蛋白7基因腺相关病毒载体的构建及其体外生物学活性［J］．西安交通大学学报，2011，31（5）：573－577．