油茶自交和异交过程花粉管生长的荧光显微观察

廖 婷 ，袁德义 ，彭邵锋 ，邹 锋

油茶自交和异交过程花粉管生长的荧光显微观察

廖 婷1，袁德义1，彭邵锋2，邹 锋1

(1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学研究院，湖南 长沙 410004)

以普通油茶‘华硕’为试材，运用荧光显微观察法，研究了其自交和异交授粉后花粉在花柱上萌发和花粉管生长变化情况。结果表明：自交和异交授粉后，花粉均能在柱头上正常萌发，且花粉管均能生长到花柱基部，但生长速度不一样，异交的生长速度略快于自交；自交授粉72 h后花粉管到达花柱基部，异交60 h到达花柱基部，自交192 h后花粉管到达胚囊；自交与异交授粉花粉管白天生长速度均显著高于晚上。

油茶；自交；异交；花粉管；显微观察

油茶Camellia oleifera 属山茶科Theaceae山茶属Camellia 植物，为常绿小乔木或灌木，是我国南方重要的木本食用油料树种[1]。油茶在我国已有2 000多年的栽培历史，主要分布在长江流域及其以南的14个省（市、区），现有油茶面积约300 hm2，年产值近200亿元，在我国经济林产业中占着十分重要的地位[2]。茶油色清味香，营养丰富，是一种优质保健食用油，深受广大消费者喜爱，被誉为“东方橄榄油”[3]。

近年来，关于油茶的研究主要集中在育苗[4-5]、土肥水管理[6-7]、病虫害防治以及良种选育等领域上，尽管在栽培技术上取得了一定的成果，然而油茶在实际生产中存在授粉受精不良的现象，表现为授粉后花粉管不能萌发和生长，从而导致油茶“座果率低、结实率低”的问题。对此，不少研究者从油茶花粉特性出发，对其花粉数量[8-9]、花粉形态特征[10-11]、花粉离体萌发[12]与贮藏[13-15]进行了大量研究，却还不够系统。油茶正常授粉后花粉在柱头上萌发及花粉管在花柱、子房中生长的行为，是油茶受精座果的前提，并直接关系到油茶能否结实。所以，开展油茶自交和异交授粉后花粉管生长行为的研究，这对生产上进行油茶合理品种配置、提高其座果率和结实率等具有一定的实践指导意义。

目前，有关山茶属自花和异花授粉后花粉管生长行为有一些报道，如梁汉兴等[16]观察了金花茶花粉粒在野山茶柱头上生长的行为，96 h到达其花柱的3/4处，120 h进入子房；杨志玲等[17]以长瓣短柱茶、浙江红山茶为试材，研究了花粉管在柱头及花柱中行为，发现花粉管在2/3花柱时伸长速度慢并形成胼胝质；王郁等[18]观察到茶树品种龙井43自交花粉可以在柱头上正常萌发并生长，授粉24 h内自交与异交花粉管生长特性无明显差异，而授粉后24 h自交花粉管生长速度明显慢于异交。然而，关于油茶的自交和异交花粉管生长行为研究的相关报道较少[11,19-20]。因此，本试验以大果油茶良种‘华硕’[21]为试材，从形态学的角度对其自交和异交花粉管的生长行为进行了荧光显微观察，以此了解‘华硕’自花和异花授粉时花粉管在花柱中的行为及其胼胝质发生的位置，为今后油茶良种合理配置、高效栽培及杂交育种提供一些基础资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料均来自中南林业科技大学马家河试验基地油茶种质资源收集圃。基地位于北纬28°06′03″，东经111°56′30″，属亚热带季风性湿润气候，四季分明，雨水充沛，日照充足，平均气温16～18℃，年平均降水量1 200 mm，平均日照1 600 h，无霜期285 d，为油茶的最适生长区域之一。供试材料为普通油茶‘华硕’（ 2009年通过国家林木品种审定），授粉品种为‘华鑫’（2009年通过国家林木品种审定），树龄30 a，树势中等，均能正常开花结果。试验地水肥条件良好，立地条件和管理措施完全一致。

1.2 方 法

1.2.1 花粉的采集

花粉采集按袁德义等[13]的方法，取大蕾期的花朵室内催花，花粉贮藏于贴有标签的小瓶中备用。

1.2.2 荧光显微观察法

在2010年11月上旬‘华硕’、‘华鑫’盛花期进行人工控制授粉，分别采集自花（‘华硕’ב华硕’）和异花（‘华硕’ב华鑫’）授粉后1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、144、168、192 h的雌蕊各10个（花柱和子房），用卡诺氏固定液（乙醇∶醋酸=3∶1）固定12 h后转入70﹪乙醇中低温保存备用。参照邹锋[20]的方法稍作修改，用8 mol/L NaOH软化4～5 h，蒸馏水冲洗后，在0.05﹪苯胺蓝溶液(0.05﹪苯胺蓝+0.15 mol磷酸氢二钾)中染色4 h，材料常规压片。在Olympus BX-51型荧光显微镜下观察，分别观测柱头上花粉的萌发和花粉管在花柱内的生长情况，并数码拍照。

1.2.3 数据分析

用数码测距软件Digimizer Image Analysis V3.1.1.0测量花粉管在花柱中生长的长度，并用Office Excel 2007软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 自交花粉管的行为

授粉的花柱经染色后，‘华硕’花粉粒和花粉管在绿色荧光的激发下呈现强烈的蓝绿色荧光，可以观察到其花粉粒在柱头上萌发和花粉管的生长情况。自花授粉后1 h，柱头上没有花粉萌发；授粉后2 h，柱头上有部分花粉粒开始萌发，少数花粉管通过乳突细胞伸入柱头（图1，a）；授粉后24 h，大量花粉在柱头上萌发，花粉管生长至花柱1/3处（图1，b）；授粉后48 h，花粉管达花柱中部，沿花柱道向下生长（图1，c）；授粉后60 h，花粉管长至花柱中下部；授粉后72 h，有部分花粉管开始到达花柱基部（图1，d）；授粉后84 h，大量花粉管到达花柱基部（图1，e）；授粉后96 h，可见花粉管开始穿过花柱基部（图1，f）；授粉后120 h，花粉管在花柱基部和子房相连的组织中生长，到达子房上端（图1，g）；授粉后192 h，花粉管到达胚囊（图1，h）。

图1 ‘华硕’自交花粉管的生长情况Fig. 1 Pollen tube growth of self-pollination in ‘Huashuo’

2.2 异交花粉管的行为

在异花授粉过程中，授粉后2 h，可见‘华硕’柱头上部分‘华鑫’花粉粒萌发（图2，a）；授粉后24 h，大量‘华鑫’花粉在柱头上萌发，花粉管生长至‘华硕’花柱1/3处（图2，b），与自交情况无明显差异；授粉后36 h，花粉管已达其花柱中部（图2，c）；授粉后48 h，花粉管长至其花柱中下部；授粉后60 h，可见部分花粉管开始到达花柱基部（图2，d）；授粉后84 h，花粉管开始穿过花柱基部（图2，e）；授粉后96 h，可见大量‘华鑫’花粉管穿过‘华硕’花柱基部（图2，f）。

图2 ‘华硕’异交花粉管的生长情况Fig. 2 Pollen tube growth of cross-pollination in ‘Huashuo’

2.3 自交与异交花粉管生长情况比较

自交和异交花粉管生长情况的比较见图3。由图3可知：‘华硕’自交和异交花粉管的生长速度不同，异交授粉生长速度比自交快。在整个生长过程中，自交花粉管于授粉后72 h生长至花柱基部，而异交花粉管则在授粉后60 h到达花柱基部。

图3 自交与异交花粉管生长情况的比较Fig.3 Comparison of pollen tubes growth in self-pollination and cross pollination

‘华硕’自交和异交花粉管各时间段平均生长速度见图4。由图4可知，‘华硕’自交和异交花粉管不同时间段的平均生长速度具有较明显的差异，且各时间段异花的花粉管均比自花花粉管生长速度快。授粉后0～2 h和2～8 h，自交和异交授粉花粉管均比其他时间段生长迅速，自交平均生长速度分别为 37.688 μm/h 和 44.735 μm/h，异交分别为43.174 μm/h 和 48.148 μm/h；授粉后 24 ～ 36 h 和48～60 h，花粉管生长相对较快；授粉后12～24 h和36～48 h，花粉管生长缓慢，自交授粉花粉管平均生长速度分别为9.343 μm/h和11.591 μm/h，异交分别为9.041 μm/h和19.841 μm/h。通过分析可知，整个过程中，自交授粉的平均生长速度为22.507 μm/h，异交授粉的平均生长速度为26.504 μm/h，两者速度相差不大。但是油茶‘华硕’自交授粉花粉管白天生长速度为 30.73 μm/h，晚上仅为 14.283 μm/h，白天速度为夜晚的2.15倍；异交授粉花粉管白天生长速度为 34.546 μm/h，晚上为 14.441 μm/h，白天速度为晚上速度的2.39倍。

图4 自交与异交花粉管各时间段平均生长速度的比较Fig.4 Comparison of average growth speed of self-pollination and cross pollination pollen tubes among each time periods

3 结论与讨论

内外因子对普通油茶‘华硕’花粉萌发和花粉管的生长有重要的影响。本实验研究对油茶‘华硕’花粉萌发和花粉管生长的观察表明，其自交和异交授粉花粉管均能生长到花柱基部，但生长速度不一样，异交的平均生长速度（26.504 μm/h）大于自交（22.507 μm/h），并且自交授粉72 h后花粉管到达花柱基部，异交60 h到达花柱基部。这与何春燕[19]对油茶‘湘林1号’、邹锋[20]对攸县油茶、李春林等[11]对油茶‘长林4号’授粉后花粉管生长速度和时间范围的结果不一，产生这种差异的可能原因与物种遗传特性、自身营养条件状况等有着密切的关系[22]。随着授粉后时间推移，油茶‘华硕’自交与异交花粉管的生长速度总体上来说呈下降趋势，前期生长快，后期生长慢，且花粉管数量逐渐减少，这种现象与Suwan等[23]提出的“二核花粉管生长分为自养阶段和异养阶段，在自养和异养阶段，花粉管生长较快，而在它们的过渡阶段花粉管生长较慢”相一致，但是有关决定油茶花粉管生长速度的因子，如钙与钙调素等对花粉管有定向生长的调控作用，这还需要进一步研究。

外因主要是花期气候环境条件影响花粉萌发[24]和花粉管生长行为[25]。本研究发现，‘华硕’自花和异花授粉的花粉管白天的平均生长速度均比夜晚的生长速度快，可能原因是‘华硕’秋冬季节开花，且实验基地位于乡村，夜晚温度明显低于白天温度，所以，花粉管晚上生长缓慢。这与范学翠等[26]对无籽八月橘的授粉后花粉管行为的研究结果类似，在阴天无风条件下异花授粉的花粉管生长速度比在晴天无风条件下自花授粉的速度慢。因此，温度也是影响油茶花粉萌发和花粉管生长的重要因子之一。

研究结果还表明，‘华鑫’花粉管在花柱和子房生长过程中并未发现胼胝质沉积和胼胝质塞出现的情况，由此说明‘华鑫’适宜做大果油茶良种‘华硕’的授粉树，在生产上应配套栽植。

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A fluorescence microscope observation on self and cross-pollination of pollen tubes in Camellia oleifera

LIAO Ting1, YUAN De-yi1, PENG Shao-feng2, ZOU Feng1
(1.Key Lab. of Non-wood Forest Products of Forestry Ministry , Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry Science, Changsha 410004, Hunan, China)

Germination of pollens and growth of pollen tubes were observed in Camellia oleifera (‘huashuo’) after self and crosspollination by fluorescence microscope observation method. The results show that the pollens in self and cross-pollination germinated normally, and the pollen tubes could reach the style base, while the values of growth speed were different. The growth speed in crosspollination was slightly faster than that in self-pollination. The pollen tubes arrived at the style base in 72 hours after self-pollination,while it took 60 hours dealing with cross-pollination, and the pollen tubes entering into the embryo sac 192 hours after self-pollination;the study also revealed that the growth speed during the daytime was significantly higher than at nighttime between in the self-pollination and the cross-pollination pollen tubes.

Camellia oleifera; self-pollination; cross-pollination; pollen tubes；microscope observation

S794.4

A

1673-923X (2012)07-0034-04

2012-04-10

国家自然科学基金项目“油茶自交败育机制研究”（31170639）

廖 婷（1989—），女，江西萍乡人，硕士研究生，主要从事经济林育种栽培研究;E-mail: liaoting19@163.com

袁德义（1967—），男，湖北随州人，教授，博士，博士生导师，长期从事经济林栽培及育种研究;

E-mail: yuan-deyi@163.com

[本文编校：谢荣秀]