蛹虫草菌的液态培养基优化

牛帅科杨自洁李 艳，2

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

蛹虫草菌的液态培养基优化

牛帅科1杨自洁1李 艳1，2

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

采用响应面法优化蛹虫草菌的液态培养基，以获得最大菌体量为响应值，采用Plackett－Burman试验筛选出主要影响因素为葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁。再利用最陡爬坡试验确定响应区域的中心点。最后利用中心复合试验确定最优的培养基配方为葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.720g/L，七水硫酸镁2.195 2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。蛹虫草菌的最终菌体总干重为3.91g/L，比优化前增加了2.48倍。

蛹虫草菌；培养基；液态发酵

蛹虫草菌，又称北冬虫夏草，是一种名贵的药用真菌。蛹虫草菌含有多种有效成分，包括核苷类化合物（又称虫草素）、虫草多糖、虫草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、维生素及微量元素等7大类具有生物活性和药理作用的化合物［1］。这些有效成分可以增强人体免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效［2］。目前市场上销售的冬虫夏草人工替代品主要是通过3类方法培育的蛹虫草菌：① 用鲜或干蚕蛹体培植出的蛹与草为一体的“蛹体虫草”；② 以大米、小麦等为主要原料，在固态人工合成培养基上培植出的“虫草菌子实体”；③ 采用液体深层发酵法培养的蛹虫草菌丝体。在药化、药理和临床试验［3］均证明它们的主要有效成分可替代天然的冬虫夏草。对蛹虫草菌进行液态发酵培养大量生产菌丝体，比固态培养蛹虫草菌子实体具有周期短、可控性强、功能性有效成分含量高等优点，且利于大规模生产［4，5］。液态发酵培养蛹虫草菌的生长受培养基组成的影响，培养基内碳源、氮源和无机盐等各种物质的加量与配比，及其各种物质间的交互作用对菌体生长和得量都有直接的影响。本试验利用响应面法，对液体培养蛹虫草菌的培养基进行了优化，目的是获得菌体最大量的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

蛹虫草菌（cordyceps sinensis）KDLMH01：由本实验室保藏；

出发菌株：衡水鹿鸣春虫草科技开发有限公司。

1.1.2 试验仪器与药品

电热鼓风干燥箱：101－0AB型，天津泰斯特仪器有限公司；

循环水式多用真空泵：SHB－III型，郑州长城科工贸有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ－LS－50SII型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

葡萄糖、蛋白胨等：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 培养基

斜面种子培养基：马铃薯琼脂（PDA）培养基。

原始培养基组成：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，自然pH 值。

1.3 培养过程

1.3.1 菌种活化 将冰箱保存的斜面菌种划线接入于固态PDA培养基平板中进行活化培养，25℃静置培养48h。

1.3.2 种子培养 切取0.5cm2平板活化菌种接入原始种子培养基进行液态种子培养，25℃静置培养3d。

对患者实施无陪护护理前、3个月后危险事件发生率以及焦虑情绪进行对比，其中焦虑情绪通过汉密尔顿焦虑量表（HAMA）给予评估，总分29分，分值越高表明焦虑情绪越严重。

1.3.3 响应面优化液态发酵培养 将种子培养液按照12.5μL/mL的接种量接种于响应面优化试验设计的各个液态发酵培养基中进行发酵培养，25℃，自然pH值，静置培养9d。

1.4 生物量检测方法

蛹虫草菌生长及生物量的检测采用菌丝体干重法，即定时取样，真空抽滤，90℃烘干2h称重，以滤纸抽滤后和抽滤前的干重差值为菌丝体干重。

1.5 响应面试验设计

1.5.1 主要影响因素的确定 设计Plackett－Burmen试验，对4因素2水平进行考察。以原始培养基组成含量设为0，高水平编码1，低水平编码－1，用minitab软件进行最终数据的处理。以0点的0.5倍为－1水平，0点的1.5倍为＋1水平，详见表1。

表1 PB试验设计的试验因子和试验水平Table 1 The experiment factor and the experiment level of PB experiment design /（g·L－1）

1.5.2 最陡爬坡试验确定中心点 根据Plackett－Burmen试验结果，决定爬坡的方向及步长，确定出中心复合试验的中心点。

1.5.3 中心复合试验 使用 Minitab软件设计3因素3水平中心复合试验。确定最优培养基配比。

1.5.4 验证实验 使用优化后的发酵培养基配方与原始培养基配方进行液态发酵对比试验、接种量、培养温度和时间等见1.3.3。以菌丝体干重为响应值。

2 结果与讨论

2.1 主要影响因素的确定

按照Plackett－Burmen两水平法设计次数为N＝4试验，对葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁、磷酸二氢钾4个因素进行考察，响应值为菌丝体干重，目的是为了筛选出影响菌体生长的主要影响因素，Plackett－Burmen试验设计及结果见表2。对Plackett－Burmen试验结果分析见表3。

由表3可知，各因素的影响程度依次是A＞B＞C＞D，A和B的P值小于0.05，属于显著影响因素；决定系数R2＝92.55%，表示该试验结果良好。最终确定显著因子A、B、C 3个因素，即葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁进行最陡爬坡试验。

表2 PB试验设计及结果Table 2 Design and results for PB experiment

表3 PB试验结果分析Table 3 The result analysis of PB experiment

2.2 中心点的确定

为了得到中心复合试验的中心点，需要利用最陡爬坡试验确定，根据Plackett－Burmen试验结果可知葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁3个影响因素的T＞0，属于正向影响，如果要提高响应值，则需要提高此三因素的浓度。初始浓度分别为20，5，0.5g/L。最陡爬坡试验设计及结果见表4。

由表4可知，前期随着葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁浓度的增加，菌体量有所增加，说明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁的增加对菌体的增量有明显的正影响。到第7组样开始降低，原因可能是高含量的葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁使培养基的渗透压提高，超过了该菌的耐渗透压极限，导致菌体量下降。第6号样是爬坡试验的顶点，即为中心复合试验的中心点，葡萄糖（A）、蛋白胨 （B）、七水硫酸镁（C）的最优浓度分别为60，20，2g/L。由此点进行中心复合试验。

表4 爬坡试验设计及结果Table 4 Design and data from the steepest ascent experiment

2.3 中心复合试验

以Plackett－Burmen试验得到的 A（葡萄糖）、B（蛋白胨）、C（七水硫酸镁）为主要影响因素，爬坡试验得到的中心点，进行中心复合试验。设计A、B、C的步长分别为10，4，0.5g/L。5个水平分别为－1.68，－1，0，1，1.68。中心复合试验设计及结果见表5，分析结果见表6。

表5 中心复合试验设计及结果Table 5 Design and results from central composite experiment

表6 中心复合试验结果分析+Table 6 Result analysis of composite experiment

该中心复合试验中心点针对3个变量5个水平总共做了18组试验，由表6可知，t值表示各因素的显著性影响，正负表示的是各个因素的影响方向。而P值大小也是作为检验各个因素的显著性影响大小的标尺，P值越低则表示其影响越显著，若P值小于5%则认定为显著影响因素［6，7］。可以看出表6中的因素：A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC、BC，其中除C、BC以外，包含7个显著项。基于表6中各个因素的系数可以创建二次回归多项式方程：

R2的大小可以解释此模型是否拟合试验结果，本试验模型决定系数为R2＝95.2%，此决定系数是通过试验中单因素和各个因素间交互作用的结果来说明此响应面结果具有多大的可变性。校正后的R2为89.8%，说明该模型与试验结果拟合度较好，试验误差较小，所以模型是合适的，可以将模型用于分析蛹虫草菌培养基的优化［8，9］。

2.4 响应面分析与最优培养基配方的确定

根据表5中的数据，应用Minitab系统软件绘制响应曲面图进行岭脊分析［10］，应用 Minitab软件绘制响应曲面图，可以直观的反映出各因素对响应值影响的变化趋势，每张图表示固定其中一个因素，另外两个因素之间的交互作用。各个因素间的岭脊分析见图1～3。

由图1可知，葡萄糖和蛋白胨作为变量，七水硫酸镁作为固定量，可以从图中直观的看到当葡萄糖量在0附近时，蛋白胨在0至1内此响应面达到最高点。图1～3皆表明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸镁的浓度在所选因素水平范围内，均有最大响应值出现，呈现较好的结果。

利用Minitab软件优化器绘制响应面优化图得到最优结果：A：0.764 5、B：1.681 8、C：0.390 7，换算为实际含量：葡萄糖为53.363 6g/L，蛋白胨为26.720g/L，七水硫酸镁为2.195 2g/L时是响应面的顶点，为最优结果。得到的理论菌体干重为4.157 5g/L。按照此配方最终得出实际菌体干重为3.910 0g/L接近理论值，优化后的培养基理论上与未优化前的1.517g/L相比可以提高2.74倍的产量，实际提高了2.48倍。

图1 葡萄糖浓度与蛋白胨浓度的响应面立体分析Figure 1 The Response surface analysis of glucose’s concentration and peptone’s concentration

图3 蛋白胨浓度与七水硫酸镁浓度的响应面立体分析Figure 3 The Response surface analysis of MgSO4·7H2O’s concentration and peptone’s concentration

3 结论

蛹虫草作为药品、保健品、食品添加剂等物质，具有较高的经济效益和开发前景，但天然的蛹虫草来源稀少，并且天然虫草菌中的核苷类物质与人工养殖相比较少［11］，这就使得人工培育特别是液态深层培养蛹虫草成为热点［12］。通过对蛹虫草菌液态培养基进行响应面优化研究，最终确定了最佳培养基比例为葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.72g/L，七水硫酸镁2.195 2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。经过优化，发酵产量与优化前相比菌体量提高了2.48倍，且此试验重现性较高，为大规模液态发酵生产蛹虫草奠定了基础。

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Optimization ofcordyceps sin en sisliquid medium by response surface method

NIU Shuai－ke1YANG Zi－jie1LI Yan1，2

（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，
Shijiazhuang，Hebei050018，China；2.R＆D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei050018，China）

This experiment used the response method to optimize the liquid medium ofcordyceps sinensis，inorder to get the biggest mycelia weight.The Plackett－Burman experiment screened out the main influence factors：glucose，peptone and magnesium sulfate.Then the path of the steepest ascent was utilized to approach the point of the optimal region.At last，the central composite experiment was done to determine the optimal formula of the medium：glucose 53.363 6g/L，peptone 26.720g/L，MgSO4·7H2O 2.195 2g/L，KH2PO40.5g/L.And the dry weight ofcordyceps sinensiswas 3.91g/L，to compare with the initial increased 2.48times.

cordyceps sinensis；medium；liquid fermentation

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.054

河北省石家庄市科技支撑计划（编号：10117901A）

牛帅科（1987－），男，河北科技大学在读硕士研究生。E－mail：nskice＠126.com

李艳

2011－12－01