农药检测用植物酯酶的筛选及提取工艺优化

江媛媛刘 芳陈庆川李 滨许 丹

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.粮食深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

农药检测用植物酯酶的筛选及提取工艺优化

江媛媛1，2刘 芳1，2陈庆川1，2李 滨1，2许 丹1，2

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；2.粮食深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

从10种植物种子中提取植物酯酶，以总酯酶活力、比活力以及对有机磷农药的灵敏性为指标，筛选出最佳植物酯酶，并研究其最优提取工艺。结果表明：大白豆的总酯酶活力和比活力均高于其它9种，对有机磷农药的敏感性也较强；大白豆酯酶的最佳提取工艺为以0.04mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液为提取液，料液比1∶6（m∶V），搅拌提取90min。

植物酯酶；有机磷农药；总酯酶活力；大白豆

中国农药残留超标现象严重，部分地区农药残留检出率、超标率高达31.68%和15.84%［1］。食用农药残留超标的农副产品可能引起慢性中毒，导致疾病的产生。随着人们健康意识的不断增强，农药残留检测越来越受到关注。色谱法等传统的农药残留检测方法不适于现场快速检测，而植物酯酶抑制法由于取材方便、快速灵敏等优点，适于现场快速检测。酶源的选择是植物酯酶抑制法检验有机磷农药残留的基础，现有的研究［2－7］显示：小麦、黄豆、绿豆、花豇豆、刺槐种子、苜蓿等植物中总酯酶活力、比活力及对有机磷农药的灵敏性较好。本试验在现有研究的基础上，扩大酶源筛选范围，旨在选出更加适合有机磷农药检测用的植物酯酶。并采用单因素和正交试验相结合的方法优化大白豆植物酯酶的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大白豆、绿豆、黄豆、小麦仁、荞麦仁、红花芸豆、黑芸豆、白芝麻、橡石、薏仁米：市售；

氧化乐果、敌敌畏、敌百虫：市售；

α－萘酚、α－乙酸萘酯、固蓝B盐：分析纯，广州沃凯化工科技有限公司；

双光束紫外可见分光光度计：UV－1800，日本岛津公司；

高速台式冷冻离心机：TGL－20M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

凯氏定氮仪：UDK142，意大利Velp公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液的制备 称取20g粉碎后的植物种子，加入0.04mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液120mL，搅拌90min，在4℃下静置过夜，4层纱布过滤后，在10 000r/min下冷冻离心10min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 α－萘酚标准曲线的制备 准确吸取1mmol/L的α－萘酚无水乙醇标准溶液0，10，20，30，40，50，60，70，80μL，加磷酸缓冲溶液至4.5mL，混合均匀，加0.5mL固蓝B盐溶液，再次混合均匀，于30℃恒温水浴显色10min。以不加α－萘酚的溶液作对照，在595nm处测定吸光度。

1.2.3 总酯酶活力测定 参考文献［8］、［9］所述方法测定植物酯酶总酯酶活力，略有改动。操作过程：试管中依次加入缓冲液3.45mL，稀释酶液1mL，16mmol/Lα－乙酸萘酯丙酮溶液50μL，混合均匀，在30℃恒温水浴锅中反应15min。然后加入0.5mL固蓝B显色剂，混合混匀，于30℃显色10min。以不加α－乙酸萘酯的反应液为对照，在595nm处测定吸光度，并根据式（1）计算总酯酶活力。将每分钟催化得到1μmolα－萘酚所需的酶量定义为1U。

式中：

E—— 总酯酶活力，U/mL；

N——酶液的稀释倍数；

K——标准曲线的斜率；

OD595——595nm处吸光度。

1.2.4 比活力的测定 根据GB 5009.5——2010《食品中蛋白质的测定》，用凯氏定氮法测定粗酶液中蛋白质含量，根据式（2）计算比活力：

1.2.5 农药敏感度测定 按照总酯酶活力的测定方法，检测浓度均为5μg/mL的氧化乐果、敌敌畏、敌百虫对总酯酶活力相对较高的5中植物酯酶的抑制程度。选择对农药抑制效果明显的植物酯酶，测定不同浓度农药下的抑制率。抑制率按式（3）计算：

式中：

I—— 抑制率，%；

E未抑制——无有机磷农药抑制时的总酯酶活力，U/mL；

E抑制——某一浓度有机磷农药抑制时的总酯酶活力，U/mL。

1.2.6 提取工艺的优化 用单因素试验的方法考察料液比、缓冲液浓度、缓冲液pH值、搅拌时间4个因素对大白豆酯酶提取效果的影响。

（1）称取一定量粉碎后的大白豆种子，分别按1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8（m∶V）的料液比添加蒸馏水，搅拌相同时间后，静置过夜，再用4层纱布过滤，在8 000r/min条件下，离心10min，收集上清夜，得粗酶液，稀释一定倍数后按照1.2.3的方法测定总酯酶活力，以确定最佳料液比。

（2）在上述体系中，按料液比1∶5（m∶V）的比例，分别加入不同pH值（5.5～8.0）的磷酸缓冲液，以确定提取剂的最佳 pH值。

（3）在上述反应体系中，按1∶5（m∶V）的料液，分别加入pH 值为7.0的不同浓度（0.02～0.12mol/L）的磷酸缓冲液，以确定磷酸缓冲液的最佳浓度。

（4）在上述反应体系中，按1∶5（m∶V）的料液，加入pH值为7.0、浓度为0.04mol/L的磷酸缓冲液，搅拌提取不同时间（30～180min），以确定最佳搅拌时间。

在上述单因素试验的基础上，设计4水平3因素正交试验，以确定最佳提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 α－萘酚标准曲线

吸光度与α－萘酚浓度的标准曲线见图1。由图1可知，决定系数达0.998 2，线性相关性良好，曲线斜率为75.708，根据总酯酶活力的计算公式，即可计算出植物酯酶的总酯酶活力。

图1 α－萘酚标准曲线Figure 1 The standard curve ofα－naphthol

2.2 不同植物种子中总酯酶活力及比活力比较

10种植物种子中蛋白质含量见表1。黑芸豆、黄豆、红花芸豆、绿豆以及大白豆中蛋白质含量较高，均超过20mg/mL。由图2可知，总酯酶活力由大到小依次为大白豆＞绿豆＞黄豆＞黑芸豆＞白芝麻＞荞麦仁＞小麦＞红花芸豆＞薏仁米＞橡实；比活力由大到小依次为大白豆＞绿豆＞黄豆＞白芝麻＞荞麦仁＞小麦＞黑芸豆＞橡实＞薏仁米＞红花芸豆。大白豆酯酶总酯酶活力和比活力均为最高。

2.3 不同来源植物酯酶对农药的敏感性

根据总酯酶活力的测定结果，选择总酯酶活力较高的5种植物种子，测定3种有机磷农药对其的抑制率，结果见表2。

表1 不同植物种子中蛋白质含量Table 1 Protein content in different plant seeds

图2 不同植物种子中总酯酶活力及比活力Figure 2 Total esterase activity and specific activity of different plant seeds

表2 农药对不同植物酯酶的抑制率Table 2 The comparison of pesticides inhibition rate on different plant esterase /%

由表2可知，氧化乐果和敌百虫对大白豆酯酶的抑制率均为最高，敌敌畏则对黑芸豆酯酶的抑制效果最明显，其次是大白豆酯酶。

由图3可知，3种有机磷农药对大白豆酯酶的抑制作用均随农药浓度增加显著加强，并呈线性关系。大白豆酯酶对有机磷农药的敏感性较强。

图3 3种有机磷农药对大白豆酯酶抑制率的比较Figure 3 The inhibition rate of 3kinds of organic phosphorus pesticides to large white beans esterase

2.4 大白豆酯酶最佳提取工艺

基于单因素试验的结果，确定了4个因素在3个水平上的正交试验，因素水平表见表3。采用L9（34）的正交试验表安排试验，所得试验结果以总酯酶活力为指标进行极差分析，结果见表4。

表3 因素水平表Table 3 Factor level table

表4 正交试验结果及分析Table 4 Orthogonal experiment results and analysis

由表4可知，各因素对植物酯酶提取效果影响为缓冲液pH值＞料液比＞缓冲液浓度＞搅拌时间，最优提取工艺为A2B2C3D3，即缓冲液pH值7.0，料液比1∶6（m∶V），缓冲液浓度0.04mol/L，搅拌时间60min。采用上述最优提取条件重复试验3次，大白豆酯酶总酯酶活力的试验值分别为11.25，11.19，11.34U/mL，工艺重现性良好。

3 结论

本试验在酶源的选择上秉承了现有的研究成果，以小麦、黄豆、绿豆等为原料，同时进一步扩大了酶源的筛选范围，选择富含蛋白质和油脂的植物种子，如大白豆、橡实等。试验结果表明，大白豆酯酶由于活力高，且对有机磷农药敏感性强，可作为检测有机磷农药残留的新酶源。但是，对于不同品种、不同产地以及不同发育阶段的大白豆，其酯酶活力及对有机磷农药的敏感性是否存在显著差异，需要进一步研究。

为了提高对大白豆酯酶的提取效率，本研究利用单因素试验和正交试验方法优化了大白豆酯酶的提取工艺，得出最佳提取工艺为：以pH值7.0，浓度0.04mol/L的磷酸缓冲液为提取剂，按料液比1∶6（m∶V）的比例，搅拌提取60min。对大白豆酯酶提取条件的优化有效提高了大白豆酯酶的提取效率，为了更有效地提高对有机磷农药的检测灵敏度，还需要对其结构进行研究，明确其作用部位。

1 尹金鹏，柳挺.南阳市蔬菜有机磷农药残留现状调查分析［J］.卫生职业教育，2010，28（10）：107～108.

2 李治祥，翟延路.应用植物酯酶抑制技术测定蔬菜水果中农药残留量［J］.环境科学学报，1987，7（4）：472～478.

3 温艳霞，李建科.有机磷农残检测用植物酯酶的研究［J］.食品科学，2006，27（4）：123～126.

4 林素英，林少琴，王军，等.豆类酯酶的提取及其在有机磷农药检测中的应用［J］.现代农业科学，2008，15（9）：14～23.

5 雷明，张檀，文建雷，等.农药残留检测用植物酯酶的筛选［J］.西北植物学报，2008，28（1）：183～187.

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9 许学勤，徐斐，吴燕雯.固定化对动植物酯酶性质的影响［J］.食品与发酵工业，2004，30（7）：38～42.

Selection of phyto esterases used in pesticide residues detection and extraction process optimization

JIANG Yuan－yuan1，2LIU Fang1，2CHEN Qing－chuan1，2LI Bin1，2XU Dan1，2

（1.Central South University of Forestry and Technology，College of Food Science and Engineering，Changsha，Hunan410004，China；2.Key laboratory for the deeply processing and quality control of grain in Hunan，Changsha，Hunan410004，China）

Phyto esterases were extracted from 10different plant seeds，the total esterase activity，specific activity and the sensitivity to organophosphorus pesticides were compared and analyzed.Then the extraction process was studied.The results showed that：the esterase of large white beans had the highest total esterase activity and specific activity，and its sensitivity to organophosphate pesticides was also quite strong.The best extraction process conditions were：concentration of phosphate buffer solution 0.04mol/L pH7.0，ratio of solid－liquid 1∶6（m∶V），and time of stirring extraction 90min.

phytoesterase；organophosphate；total esterase activity；extraction process

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.018

江媛媛（1986－），女，中南林业科技大学在读研究生。E－mail：jyy1000＠126.com

刘芳

2011－12－01