利用dsDNA层层膜检测芬顿试剂对天然DNA的损伤

(甘肃工业职业技术学院化工学院，甘肃天水74025)

利用dsDNA层层膜检测芬顿试剂对天然DNA的损伤

廖天录，刘军

(甘肃工业职业技术学院化工学院，甘肃天水74025)

凭借聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)和带负电荷的DNA存在的相互之间的静电作用交替吸附在玻碳电极表面，进而形成非常有序的{dsDNA/PEI}2层层膜.采用槲皮素作为电活性指示剂来检测芬顿试剂对天然dsDNA的损伤.由于槲皮素在DNA多层膜中具有的非常特别的可逆吸入模式，这中模式能够明显分辨损伤和未损伤DNA多层膜的吸入量.由此检测芬顿反应引起的DNA的氧化性损伤，可以提供一种新的检测DNA损伤的电化学方法.

dsDNA层层膜;芬顿试剂;槲皮素;DNA损伤

DNA是生物遗传信息的基本载体.一般它的分子结构不会在活动过程中改变，然而，生物体内外部的一些物理和化学因素很有可能使得它的分子结构发生异常变化，这就称为是DNA的损伤［1］.所以，研究DNA损伤的检测具有重大意义，它对于新化合物的毒性筛选、生物污染物的检控以及生态毒性学研究具有现实意义.电化学方法是检测DNA损伤的一种新的可选择的检测手段［2－3］，它具有简单、快速、灵敏、价格低等诸多优点.过氧化氢与催化剂Fe2+构成的氧化体系通常称为芬顿试剂.芬顿反应产生羟基自由基对DNA的损伤已得到证实［4］.本文中，采用槲皮素作为电活性指示剂与dsDNA的嵌入作用来检测芬顿试剂对天然DNA的损伤.

1 实验部分

1.1 试剂

聚乙烯亚胺(PEI，MW－1800)购于Alfa Aesar公司;小牛胸腺DNA(北京华美生物工程公司);双氧水(H2O2，质量分数30%)购于天津市化学试剂公司;硫酸亚铁(FeSO4)购于与成都临江化工厂;槲皮素购于中国科学院兰州化物所;其它所用试剂均是分析纯，水是于4℃条件下储存的二次蒸馏水.在每次试验前均需用高纯度氮气除去氧气.除了DNA损伤的实验外所有实验都是在室温(20±2)℃下进行的.本实验所用的0.1mol/L醋酸盐缓冲溶液(pH=5.0)均需进行CV测试.

1.2 仪器

CHI832电化学工作站(美国)上完成，Branson200超声清洗仪(美国);pHS－3C型酸度计(上海);石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B，上海亚太技术玻璃公司)，玻碳电极的直径是3.5mm.

1.3 实验过程

(1)先用0.1μm和0.05μm的抛光粉对玻碳电极分别进行抛光，之后将抛光好的玻碳电极放到超声清洗器里使用准备好的丙酮和二次水分别进行5分钟的清洗，接下来再用氮气将其吹干.之后再将该电极交替分别浸入到聚乙烯亚胺和dsDNA中各10分钟，直至他们能够交替吸附到电极表面，这中间还需用二次水冲洗，此时会形成一层膜它就是{dsDNA/PEI}膜.然后依据设计好的膜层数再对上述实验过程操作2次，最后可以获得多层膜{dsDNA/PEI}2.

(2)室温下在5mL电解池中进行循环伏安实验.工作电极为裸玻碳电极、DNA修饰电极或DNA与槲皮素产物的修饰电极.铂电极为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极.

(3)槲皮素吸入上面的多层膜是通过将该膜电极浸泡在1×10－4mol/L槲皮素缓冲溶液(pH=5.0，含0.1M NaCl)里，不断搅拌至少2小时直到达到吸入平衡或稳定状态.此时吸入槲皮素量最多状态的膜就被指定为{dsDNA/PEI}2－QC膜，然后利用醋酸缓冲液对该膜进行清洗并用氮气吹干，之后将它放入到醋酸缓冲液中进行CV扫描.在此状态的DPV氧化峰电流就被定为I0.之后把该状态的该膜在醋酸缓冲液中进行浸泡一夜，使QC从膜中最大限度的释放出来，而且还需不间断的把该膜放入醋酸缓冲溶液中进行CV扫描.而针对DNA损伤实验，我们需要把充分吸附了槲皮素的该膜放入到缓冲液中1小时使尽可能多的在膜中非特殊键合槲皮素释放出来［5］.然后将该膜放入到含硫酸亚铁(1.5mmol/L)和双氧水(0.5mol/L)的醋酸盐缓冲溶液中［6］，并在37℃下搅拌一段时间对DNA的损伤.为了除去DNA膜上吸附的芬顿试剂与非特殊键合槲皮素，再把损伤的该膜放入到缓冲溶液中浸泡1小时.之后将损伤的该膜放入醋酸缓冲液中CV扫描，此时CV氧化峰电流指定为It.而且每次检测对上述过程至少重复3次，DNA损伤实验都在暗室中进行.

2 结果和讨论

把充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜先浸泡到缓冲液里1小时为使更多的在膜中非特殊键合槲皮素能够释放出来［6］.然后使该膜在芬顿试剂中37℃下温浴并搅拌一定时间对DNA损伤.为了除去吸附于膜上的芬顿试剂和非特殊键合槲皮素.还需再将DNA受损伤的膜浸泡于缓冲液中1小时，浸泡之后立即将吸入大量槲皮素的膜电极放入到醋酸缓冲液中进行CV测试.图1是该膜在芬顿试剂中温浴不同时间的循环伏安图.从该图不难看出，随着温浴时间的不断增加，氧化还原峰电流反而不断减小.此现象说明受损伤的dsDNA多层膜能够吸入的槲皮素根本不能达到未损伤的dsDNA多层膜吸入的槲皮素的相同水平，对dsDNA在{dsDNA/PEI}2中的损伤检测是通过循环伏安实验进行.实验中，每个膜电极只能循环使用一次.为了保证膜电极变化的真实性，必须使用新制成的膜电极重复实验.

通过氧化峰电流的比率与膜在芬顿试剂中温浴时间的斜率可以测定dsDNA在该膜中的损伤率(图2)，其中，I0和It分别是该膜在芬顿试剂溶液中没有温浴和温浴时间t(t在10分钟之内)的氧化峰电流.用相对峰电流的比率代替绝对峰电流是为了有效的测定DNA的损伤.相对峰电流的比率随着在芬顿试剂溶液中温浴时间线性增加，损失率为0.3843min－1，相关系数为0.9981，证明了我们建立在以槲皮素作为电活性指示剂与dsDNA层层膜相结合的基因毒性传感器可以有效的检测DNA损伤.

在含亚铁离子的酸性液中添加一定量的过氧化氢时，H2O2能够生成一种氢氧自由基(Fe2+作为催化剂)，又因为羟基自由基可以产生对DNA的氧化损伤，进而导致DNA的链产生断裂，从而生成8－氧鸟嘌呤(8－oxo－G)和一些其它的加合物［7－8］.芬顿反应诱导氧化DNA将扰乱或完全破坏一些在DNA双螺旋邻近碱基对形成的π－π堆积.在我们的实验中，由于槲皮素分子能够嵌入到DNA双螺旋邻近碱基对当中，因此才有大量的槲皮素分子吸入到{dsDNA/PEI}2膜，尤其是浸入到缓冲溶液中1小时之后，损伤的DNA就能够从受到破坏的双螺旋结构中把大量的槲皮素分子释放出，此时的CV响应会减小，这也说明在最初10分钟之内相对峰电流的比率随着在芬顿试剂中温浴时间的增加而线性增加，这是因为羟基自由基不稳定，而且存在的时间也较短，然而在温浴10分钟以后，反而CV的峰电流不再会随着温浴时间的增加而减少.这其中的原因是在温浴最初的10分钟之内膜中易受损伤的DNA的活性点已经完全消耗殆尽.

图1 充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬顿试剂溶液中温浴不同时间的循环伏安

图2 氧化峰电流的比率与{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬顿试剂溶液中温浴时间的斜率

3 结束语

本文采用槲皮素作为电活性指示剂吸入{dsDNA/PEI}2膜，进而凭借芬顿试剂对天然DNA损伤进行检测，由于槲皮素所拥有的DNA多层膜中的非常特别的可逆吸入方式，凭借它我们可以很好分辨出槲皮素在损伤和未损伤DNA多层膜中的吸入量，并将槲皮素从膜中的漏泄量减少到最小.槲皮素能够嵌入到双链DNA与其结合.因此{dsDNA/PEI}2－QC能够成功检测出芬顿试剂对天然DNA的损伤.该膜系统将为我们今后找到更多合适体系检测DNA的损伤提供了引导.作为DNA损伤传感器可以为化学损伤DNA提供一个普遍的、灵敏的检测方法.

［1］Babkina S S，Ulakhovich N A.Complexing of Heavy Metals with DNA and New Bioaffinity Method of Their Determination Based on Amperometric DNA－Based Biosensor［J］.Anal.Chem.，2005，77:5678－5685.

［2］Palecek E，Fojta M，Tomschik M，Wang J.Electrochemical Biosensors for DNA Hybridization and DNA Damage［J］.Biosens Bioelectron，1998，13(6):621－628.

［3］Tianlu Liao，Yanfeng Wang，Xibin Zhou，et al.Detection of DNA damage induced by styrene oxide in dsDNA layer－by－layer films using adriamycin as electroactive probe［J］.Colloids and Surfaces B，2010，76(1):334－339.

［4］Zhenyu Lin，Jianjun Sun，Jinhua Chen，et al.Electrochemiluminescent Biosensor for Hypoxanthine Based on the Electrically Heated Carbon Paste Electrode Modified with Xanthine Oxidase［J］.Anal.Chem.，2008，80(8):2826－2831.

［5］Lu X Q，Chen Y N，Chen J，Zhang Y，et al.Electrochemical Studies of the Interaction of Quercetin with DNA［J］.Int.J.Electrochem.Sci.，2006(1):130－138.

［6］Elicia L S，Wong and J，Justin Gooding.Charge Transfer through DNA:A Selective Electrochemical DNA Biosensor［J］.Anal.Chem.，2006，78(7):2138－2144.

［7］Halliwell B.Oxygen and nitrogen are pro－carcinogens.Damage to DNA by reactive oxygen，chlorine and nitrogen species:measurement，mechanism and the effects of nutrition［J］.Mutat Res，1999，443:37－52.

［8］Floyd R A.The role of 8－hydroxyguanine in carcinogenesis［J］.Carcinogenesis，1990(11):1447－1450.

Q523

A

1008－7974(2012)08－0021－02

2011年甘肃省天水市市级财政专项资金项目;甘肃工业职业技术学院基金项目(Gzy2011－17).

2011－10－23

廖天录(1974－)，甘肃天水人，硕士，甘肃工业职业技术学院化工学院讲师.

(责任编辑:水行)