金莲花中荭草苷在兔体内组织中的分布特征研究

陈凤平，曲彩红，安 芳，王书华

（1.河北科技大学党政办公室，河北石家庄 050018；2.河北北方学院药学系，河北张家口 075000）

金莲花中荭草苷在兔体内组织中的分布特征研究

陈凤平1，曲彩红2，安 芳2，王书华2

（1.河北科技大学党政办公室，河北石家庄 050018；2.河北北方学院药学系，河北张家口 075000）

建立HPLC法测定兔组织中荭草苷含量的方法，研究静脉给药时，荭草苷在新西兰白兔体内组织中的分布特点，荭草苷给药后，分时采集组织样品，放血处死动物，取出心、肝、脑、肾、肺、脾组织并制备匀浆，以HPLC法测定兔组织中荭草苷含量，采用统计矩理论计算各个组织的AUC。组织中的内源性物质不干扰荭草苷的测定，在0.050 0～50.0 mg／L范围内，荭草苷质量浓度和峰面积线性关系良好，定量下限为0.050 0 mg／L。精密度、准确度和加样回收率RSD值均小于15%。各组织的AUC顺序为肾＞肝＞肺＞脾＞心＞脑。将各组织AUC进行对数转换后，依次进行正态性检验、方差齐性检验和方差分析，结果显示，不同组织的AUC有显著性差异（p＜0.05），荭草苷在新西兰白兔体内主要组织中的含量分布有明显不同。

荭草苷；分布；HPLC

金莲花是毛茛科属植物金莲花的干燥花及花蕾，在中国主要产于山西、河北、内蒙、辽宁等省区。金莲花作为中医药历史悠久，主要含有黄酮类、有机酸、挥发油等［1－3］化学成分。前期研究表明，金莲花总黄酮具有体外抗氧化、抗癌等［4－8］药理活性。荭草苷在金莲花总黄酮中含量较高［9］。荭草苷具有抗血栓、对缺血缺氧心肌有保护作用［10－11］。目前，对荭草苷的研究主要集中在其药理作用上，对其兔体内组织分布的研究尚未见报道［12］。该实验的完成，为进一步阐明荭草苷在人体内的药物代谢动力学过程及药物的临床合理应用提供理论依据。同时，对荭草苷作为一种临床新药开发有非常重要意义。

1 实验材料

1.1 实验动物

新西兰纯种白兔，体重（2.3±0.3）kg，♂ ，由河北北方学院动物中心提供，室温饲养1周。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪，Heraeus高速冷冻离心机，GR-202型分析天平，DY89-I型电动玻璃匀浆机。野生金莲花采自河北省张家口市沽源县，经河北北方学院药物研究所鉴定为金莲花，荭草苷、牡荆苷对照品（中国药品生物制品检定所提供），动物实验用荭草苷由河北北方学院实验中心提供（纯度达98%以上），乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂为化学纯，实验用水为三重蒸馏水。

2 方法、结果与讨论

2.1 兔给药后组织中荭草苷的含量测定

2.1.1 给药方案和组织样品采集

新西兰白兔42只，禁食过夜12 h，自由饮水，随机分组，每组6只，随机分成7组，耳缘静脉注射荭草苷（20 mg／kg）后，于5，10，15，30，45，60，75 min分别放血处死，迅速解剖，采集心、肝、脑、肾、肺和脾各3.5 g。

2.1.2 组织匀浆液的制备与处理方法

各组织用生理盐水冲净表面浮血，用滤纸吸干表面水分后，精密称重，剪碎，按1 g∶1 m L比例加入相应体积的生理盐水，用电动匀浆器在冰浴下匀浆，制备50%（体积分数）的组织匀浆液。将匀浆液4 000 r／min离心10 min后，取上清液200μL，加入2倍体积的乙腈沉淀蛋白，10 000 r／min离心10 min去除蛋白后，收集上清液，0.45μm的微孔滤膜过滤后，置－20℃冷冻保存备测。

2.1.3 HPLC测定条件

色谱柱为 Hypersil BDS-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相为V（1%乙酸）∶V（乙腈）＝85∶15；检测波长为340 nm；柱温30℃；流速1 m L／min；进样量20μL。

2.1.4 各组织标准曲线的制备

取上述各组织的上清液1 m L，加入不同量的荭草苷标准溶液，配制质量浓度分别为0.050 0，0.100，0.500，2.50，5.00，10.0，12.5，25.0，50.0 mg／L的一系列荭草苷各组织匀浆液样品，按组织匀浆处理方法处理，HPLC测定，用荭草苷的峰面积对质量浓度进行回归，得到兔各组织匀浆液的标准曲线方程。结果表明在0.050 0～50.0 mg／L范围内，荭草苷质量浓度和峰面积线形关系良好，r＝0.998 6～0.999 5，定量下限为0.050 0 mg／L。在色谱条件下检测组织样品中荭草苷，荭草苷的保留时间为4.9 min，组织中的内源性物质不干扰荭草苷的测定。

2.1.5 方法的精密度和准确度

取空白各组织液100μL，配制高、中、低3个质量浓度的组织样品，质量浓度分别为0.100，10.0，40.0 mg／L，按标准曲线制备方法同法测定，每个质量浓度平行测定5次。将这3个质量浓度样品日内不同时间测定5次，计算日内精密度。在同一周内的不同日将上述3个样品分别测定5次计算日间精密度。结果显示：精密度和准确度均符合生物分析方法指导原则的要求，RSD值小于15%。

2.1.6 稳定性实验

取空白组织液100μL，配制2个质量浓度的组织样品，质量浓度分别为2.50，50.0 mg／L，3个样本。分别在室温放置6 h和24 h后重新进样，并以当日的标准曲线测定质量浓度，取这2个质量浓度的3个样本经3次冷冻融解后进行浓度测定，考察其稳定性。结果表明，荭草苷组织样品在室温放置6 h和24 h后，样品准确度的RSD均小于15%，说明样品在室温条件下6 h内稳定性良好，每天可以进行大批量的样品处理。冻融实验结果的RSD值小于15%，说明其在此条件下，稳定性良好。

2.1.7 组织分布

新西兰白兔经耳缘静脉注射荭草苷后，各组织药物质量浓度和时间数据见表1。结果表明，不同组织同一时间荭草苷含量呈显著性差异（p＜0.05），兔体内荭草苷以整体平均含量从5～75 min其下降幅度为88.5%，其器官在5～75 min荭草苷从其浓度的高峰至低峰，下降幅度分别为心脏93.7% 、肝脏93.8% 、脑79.4%、肾脏95.9% 、肺76.2% 、脾脏95.1% 。心脏、肝脏、脑、肾、肺、脾组织中药时曲线下面积AUC值分别为23，226，12，452，149，41μg·min／g。

表1 荭草苷在各组织中的含量Tab.1 Concentration of orientin in different tissues

2.2 讨 论

2.2.1 荭草苷生物样品的处理方法

荭草苷属于黄酮类化合物目前，黄酮类化合物生物样品的处理方法有以下几种：蛋白沉淀法和液液萃取法、固相萃取法。该实验中所用的组织中含有大量蛋白，它们能与药物结合，影响药物的检测，本实验采用了沉淀蛋白的方法。实验中筛选甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯几种有机溶剂用来沉淀蛋白，通过比较，乙腈沉淀的蛋白较细，经HPLC检测，乙腈中荭草苷的含量高于其他溶剂，而且没有出现溶剂效应影响色谱峰的现象，用乙腈保证了色谱峰型的对称，又保证了高的除蛋白率，所以最终确定了用2倍体积的乙腈来沉淀蛋白。

2.2.2 色谱条件的确定

在此色谱条件下，通过对荭草苷组织样品方法学考察，对照品和处理过的空白样品、回收率的测定及稳定性的考察，得出此分析方法具有稳定性好、灵敏度高、重现性较好等特点，适宜荭草苷在血浆及兔体内的分析。

2.2.3 荭草苷的组织分布

药物在体内的分布与药理作用有密切关系，决定了药效的强弱和作用的持续时间。本实验考查了荭草苷静脉注射后在兔体内的组织分布情况。研究发现，随着时间的变化，兔静注荭草苷后，以肾、肝、肺中荭草苷含量最高，这可能与脏器中血管丰富、血流量大有关。荭草苷在脑组织中的含量最低，可见荭草苷不易透过血脑屏障。给药后，随时间变化，除肾组织外，其他各组织中荭草苷含量均呈逐渐下降趋势。给药后15 min时，荭草苷在肾组织中含量达最高。这证实了中医理论所认为的金莲花具有清热解毒、滋补肾阴、利尿通便的作用。兔体内荭草苷以各组织整体平均含量从5～75 min其下降幅度为88.5%，说明荭草苷不会在兔体内产生蓄积中毒的现象。

采用统计矩理论计算各组织的AUC，各组织中AUC顺序为肾＞肝＞肺＞脾＞心＞脑，说明荭草苷在肾中分布最多，在脑中分布最低。将各组织AUC进行对数转换后，依次进行正态性检验、方差齐性检验和方差分析，结果显示，不同组织的AUC有显著性差异（p＜0.05）。

本实验研究了荭草苷在兔体内的组织分布情况，但其在动物体内代谢情况如何？发挥药效是原型药物还是其代谢物？代谢产物结构如何？了解这些对研究其作用机制、明确金莲花的药效物质基础将有重要的参考价值。这些还有待进一步研究。

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Distribution of orientin fromTrollius Chinensisin tissue of rabbits

CHEN Feng－ping1，QU Cai-hong2，AN Fang2，WANG Shu-hua2

（1.Department of Party and Government Administration，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China；2.Department of Pharmacology，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China）

A method using HPLC is established to determine orientin in tissue of rabbits and to study the characteristic of the orientin when injected into veins.After orientin is injected into veins，tissue samples are collected at time sharing.The rabbit is put to death by bloodletting，then the heart，liver，brain，kidney，lung and spleen are taken out to prepare homogenate tissue.HPLC is used for determination of orientin in tissue of rabbits.Theory of statistical moment is used to account AUC of each tissue sample.Endogenous material in tissue does not interfere in determination of orientin.In amplitude of 0.050 0～50.0 mg／L，mass concentration of orientin and peak area have a good linear relation，and the quantitation of lower limit is 0.050 0 mg／L.The RSD of precision，accuracy and plus sample recovery are all less than 15%.The AUC order of each tissue is kidney＞liver＞lung＞spleen＞heart＞brian.After log transition of AUC data，normality test，homogeneity test for variance and analysis of variance are conducted.The result shows AUC of each tissue have significant difference（p＜0.05）.Orientin distribute in dominating tissue of rabbits is obviously different.

orientin；distribution；HPLC

R285.5

A

1008-1542（2012）01-0036-04

2011-10-16；

2011-11-26；责任编辑：李 穆

河北省教育厅科学研究计划项目（2008101）

陈凤平（1965-），女，河北滦南人，副教授，主要从事机关及教学管理方面的工作。

王书华教授