高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究

岳修乐，李争艳，徐世健，张 华，安黎哲

（1.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州730000；2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥230031）

随着分子生物学的发展，越来越多的研究需要从转录水平上着手，深入分析研究基因的功能，如基因全长cDNA序列的克隆、基因表达模式的研究（Real-Time PCR、Northern Blotting等）、cDNA 文库构建、基因芯片分析、小RNA的筛选等，而获取高质量的RNA是这些实验成功的第一步［1-4］。

高山离子芥（Chorisporabungeana）属十字花科草本植物，主要分布在我国新疆天山山脉一号冰川雪线附近，常年忍受着冷冻胁迫和剧烈的温度变化，是一种典型的冰缘植物，是研究抗冻机制的理想材料［5-9］，对于利用其抗冻基因对农作物进行抗冻性改良，提高寒流等恶劣条件下的生存率和产量等具有广泛前景和深远意义［10-11］。但是，作为低温生物学领域一种比较新的研究对象，由于没有太多借鉴，在研究时，经常会出现RNA提取不稳定、提取条件不好把握、操作繁琐、容易降解的难题。鉴于此，本研究采用不同的提取方法、保存温度和时间，以及提取前后的RNA酶处理等，探讨高山离子芥高质量RNA的提取方法，深入分析影响RNA质量的关键因素，并对条件进行优化，以期为冰缘植物高山离子芥的深入研究夯实基础，为其他物种的RNA提取提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 高山离子芥愈伤组织 高山离子芥愈伤组织的获取方法参照文献［12-13］，并进行了一些修改。成熟的高山离子芥种子去皮，用70%的乙醇浸泡30s，离心后加入2%的次氯酸钠和0.01%的TritonX-100，轻柔振荡10min，之后离心用无菌水清洗5～7次，子叶用无菌手术刀切断后种植于MS诱导培养基（MS＋1mg·L-12，4-D＋0.2 mg·L-16-BA＋30mg·L-1蔗糖＋0.6%琼脂，pH值为5.7），获得的愈伤组织在继代培养基（MS＋0.5mg·L-12，4-D＋0.1mg·L-16-BA＋0.5mg·L-1NAA＋30mg·L-1蔗糖＋0.6%琼脂，pH值为5.7）上进行培养。培养条件为18℃，16h光照8h黑暗，湿度为60%。新鲜材料直接使用或液氮速冻后-80℃保存备用。

1.2 RNA提取前的准备工作 实验中用到的枪头、离心管等浸泡在0.1%的DEPC水中，1）完全浸泡：枪头朝下浸没在DEPC水中，离心管浸没后，用镊子或玻璃棒驱离残留在管底的气泡。2）不完全浸泡：枪头和离心管随意放置在玻璃容器后加入DEPC水中。室温摇动过夜，第2天在超净台转移出液体到一试剂瓶，和处理过的枪头、离心管、干净的研钵、镊子等一起高温（121℃）灭菌30min。超净台、移液器等工具用75%乙醇擦拭备用。

1.3 RNA的提取

1.3.1 改良的Trizol法 根据Invitrogen公司Trizol试剂说明书［14］，称取100mg新鲜的高山离子芥愈伤组织（或保存在-80℃的样品），放入液氮预冷过的研钵中，添加液氮，研磨至粉末状，研磨过程中不要使液氮干掉；加入1mL Trizol试剂到研钵中，Trizol试剂遇冷会凝固，继续研磨至Trizol完全融化成液体，这时样品应均匀混合在试剂中。自研钵吸取混合液到一支新1.5mL离心管中，加入200 μL氯仿，剧烈震荡混匀20～30s，室温静置5min，4℃14 000r·min-1离心10min，吸上清约500μL到一支新离心管中，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1，pH 值5.1），再次剧烈震荡20～30s，室温静置5min，然后4℃14 000r·min-1离心15 min。离心后，吸上清约400μL到一支新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置3～5 min后4℃10 000r·min-1离心10min；弃上清，加入1mL 75%的乙醇，颠倒使白色沉淀悬浮，4℃10 000r·min-1离心5min；重复用75%的乙醇洗盐一次，操作同上一步；然后弃上清，用移液枪吸干残留的液体，超净台内风干10min，加DEPC水50 μL溶解，直接使用或-80℃保存备用。

1.3.2 CTAB 法 参照李高等［15］及 Chang等［16］的方法。称取100mg新鲜组织在液氮中充分研磨成粉末状，加入650μL CTAB提取液［2%CTAB，2 mol·L-1NaCl，2%PVP，0.1mol·L-1EDTA（pH 值8.0），25mmol·L-1EDTA（pH 值8.0），2%巯基乙醇］，立即振荡混匀，65℃水浴10min，期间每2min上下颠倒1次；加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1，体积比），剧烈震荡30s，4℃14 000r·min-1离心15min；吸上清到一支新的无RNase的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿／异戊醇（24∶1，体积比），再次剧烈震荡30s，4 ℃14 000r·min-1离心15min；吸上清到一支新的无RNase的1.5mL离心管中，加入DNase I进行消化（参照NEB公司DNase I试剂说明，Catalog No.M0303L），37℃水浴1h。充分消化后，加入等体积的氯仿／异戊醇（24∶1，体积比），剧烈震荡30s，4℃14 000r·min-1离心15min；上清液转移到另一支新的无RNase的1.5mL离心管中，加入1／3体积的8mol·L-1LiCl，颠倒混匀，-20℃ 静置2h；之后，4℃14 000r·min-1离心20min，弃上清，加入1mL 70%乙醇，上下颠倒混匀，4℃10 000 r·min-1离心5min。室温晾干，加入50μL DEPC水溶解沉淀。

1.3.3 柱式离心法 操作完全按照Tiangen公司总RNA提取试剂盒说明书（Tiangen总RNA提取试剂盒，Catalog No.DP419）。

1.4 RNA的检测

1.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测 用去离子水配置0.4 mol·L-1的NaOH，浸泡电泳槽、制胶板及制胶梳，30min以上，之后用DEPC水清洗，用DEPC水配置电泳缓冲液，在DEPC水处理过的三角瓶中配置1%的琼脂糖凝胶，电泳检测RNA的质量。出现清晰的3条带，第1条带（28SrRNA）是第2条带（18S rRNA）的2倍亮度为最佳［17］。

1.4.2 吸光度分析 取2μL提取的RNA稀释50倍，用微量比色皿对RNA在260、280和230nm的吸光度进行检测。OD260／OD280在1.8～2.0为佳，OD260／OD230大于1.8为佳［17-18］。

1.4.3 RT-PCR检测 取2μg经DNA酶（Formentas，Catalog No.EN0521）消化过的总RNA，反转录成cDNA，方法参照 M-MuLV Reverse Transcriptase 产 品 手 册 （Formentas，Catalog No.EP0351）。以1μL反转录的cDNA为模板，扩增高山离子芥看家基因CbACTIN（GeneBank Accession No.AY82536）来检测RNA质量对后续研究的影响，CbACTIN的引物为，

扩增条件为94℃ 预变性2min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 RNA的保存 分别采用室温（25℃）、-80℃保存RNA，在特定的时间进行电泳检测，来观察保存温度对RNA造成的影响。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取RNA结果分析

2.1.1 RNA纯度和得率 Trizol法、柱式离心法和CTAB法提取高山离子芥RNA，得到的RNAOD260／OD280分别在1.88～1.95、1.92～1.98和1.38～1.42，OD260／OD230分别在 2.03～2.21、1.95～2.31和0.83～1.23（表1）。说明柱式离心法得到的RNA纯度最高；改良Trizol法的纯度和柱式离心法的非常接近，也比较纯，可以满足各种后续研究对RNA的要求；CTAB法纯度较低，对于很多后续的实验要求都很难满足。改良Trizol法、柱式离心法和CTAB法得率分别在29.6～35.2、14.8～17.9和17.5～23.3μg·g-1（表1）。改良Trizol法的得率最高，柱式离心法的得率最低，对于需要大量RNA的后续研究，改良Trizol法是最佳选择。

表1 不同方法提取RNA的吸光度检测Table 1 OD value of extracted RNA by different methods

2.1.2 RNA完整性分析 改良Trizol法和柱式离心法都能获得较高质量的RNA，尤其是改良Trizol法提取的RNA完整性最好，条带清晰，28SrRNA条带亮度接近18SrRNA的2倍（图1）。CTAB法得到的RNA条带出现一定程度的降解。

图1 3种不同的方法提取高山离子芥RNA得到的电泳图Fig.1 Electropherogram of RNA from three different extraction methods

2.1.3 RT-PCR检测结果 将3种不同的方法提取的RNA反转录成cDNA，以此为模板扩增高山离子芥看家基因CbACTIN。结果发现，改良的Trizol法和柱式离心法均能得到较好的扩增效果，而CTAB法得到的条带非常弱，扩增效果比较差，难以达到后续实验的要求（图2）。

图2 高山离子芥看家基因CbACTIN扩增后的电泳图Fig.2 Electropherogram of Chorispora bungeana housekeeping gene CbACTIN

2.2 枪头、离心管去RNA酶处理不完全的结果 比较枪头、离心管不完全浸泡和完全浸泡DEPC水对RNA质量造成的影响，完全浸泡可以得到比较清晰的条带，而不完全浸泡则发生大量降解（图3）。

2.3 保存条件对RNA的影响 溶解在水中的RNA保存在室温时，在8h后出现少量降解，20h后已经大部分开始降解（图4），所以最好8h以内使用，否则将会影响下游的实验；而在-80℃的RNA则可以保存较长的时间，至少30d之内使用没有问题（图5）。

图3 枪头、离心管等去RNA酶处理对RNA质量的影响Fig.3 The influence of residual RNase on RNA integrity

图4 室温保存不同时间对RNA的影响Fig.4 The influence of different storage time at room temperature on RNA integrity

2.4 电泳槽及电泳液去RNA酶处理前后RNA电泳的结果 在去RNA酶处理后进行的电泳，条带清晰，没有发生降解；而在没有处理的条件下进行的电泳，RNA基本完全降解（图6）。

3 讨论与小结

图5 －80℃保存30d对RNA的影响Fig.5 The influence of 30days storage at－80℃on RNA integrity

图6 电泳槽和电泳液RNA酶灭活处理前后对RNA电泳结果的影响Fig.6 The influence on RNA electrophoresis results before and after RNase inactivation treatment in electrophoresis tank and solution

3.1 提取方法的选择 物种不同，往往其体内的各物质含量也不尽相同［19-21］，蛋白质、酚类、多糖等物质的含量高低，是影响RNA提取质量的重要因素［17］，这就要求研究人员根据物种的具体情况调整RNA提取的方法和步骤，采取最合适的方法提取高质量的RNA，从而保证后续研究的可靠性。高山离子芥作为一种冰缘植物，具有极强的抗寒能力，分析检测证明其体内含有较高的脯氨酸及可溶性多糖的含量［22-23］。本研究分别采用改良的Trizol法、柱式离心法和CTAB法对高山离子芥进行RNA的提取，结果证明，改良的Trizol法、柱式离心法都可以得到较高质量的RNA，但是前者有更高的RNA得率，考虑到分离柱对RNA的大小具有选择性，对特定范围内的RNA有较好的吸附能力，特别大或特别小的RNA则很难吸附甚至无法吸附。所以，建议采用改良的Trizol法来提取高质量的RNA，进行后续的研究。在对RNA的要求较低时可以考虑采用柱式离心法。而CTAB法表现出操作繁琐、耗时长、提取质量不高的弱点，不建议采用。

3.2 枪头、离心管的处理对RNA质量的影响在提取RNA之前要用DEPC水浸泡枪头、离心管等直接和RNA接触的工具，灭活RNA酶，如果处理不充分将会造成RNA的降解。然而，简单的把枪头和离心管放入DEPC水中并不能做到完全的浸泡，致使实验失败仍难于找出原因，这主要是由于枪头、离心管等塑料器具，在DEPC水中浸泡时，会飘浮起来，或者在离心管底残留气泡，即使长时间摇动也很难去除，所以，这和没有经过DEPC水处理的枪头、离心管并无区别，导致实验失败。本研究改良的方法是：对于枪头，选用较细的试剂瓶，使枪尖朝下保持竖直浸没在DEPC水中；对于离心管，在浸没DEPC水中之后，用长镊子或细玻璃棒在有气泡的离心管底部轻轻搅拌，逐一驱离气泡，保证完全浸没，达到灭活RNA酶的效果。

3.3 样品品质对RNA品质的影响 样品的品质相当于先天性因素，没有好的样品品质就难以提取高品质的RNA，所以RNA的提取一定要尽量选用新鲜材料，或者采集后液氮速冻-80℃短期保存的材料。另外，样品要选取新鲜部位的组织，不要采集衰老部位的组织。对于提取RNA时样品的起始量上，一定要保证100mg样品加入1mL Trizol，超出这个量很可能会造成RNA降解、抽提不干净、蛋白质或无机物污染等。

3.4 电泳试剂去RNA酶的处理对RNA检测的影响 电泳液及电泳槽等工具对RNA完整性的检测结果也有着重要影响，处理不好会使检测结果不能真实反映提取的RNA质量，本研究比较了电泳槽经0.4mol·L-1的氢氧化钠浸泡30min以及用DEPC水配置的缓冲液进行电泳和不作这些处理进行的电泳，结果显示，在没有处理的电泳槽里跑的RNA基本上完全降解，说明电泳试剂及工具的RNA酶灭活是影响检测结果非常大的因素，这一步RNA酶的灭活不容忽视。

3.5 保存条件对RNA的影响 在提取RNA后，需要进行质量的检测以及定量分析，有时还需进行酶切消化再提纯等的操作，这会消耗一定的时间，针对长时间操作后RNA质量是否完好的问题，本研究进行了室温和-80℃的保存检测，实验证明，提取之后溶解在水中的RNA可以在-80℃保存较长的时间，30d之内使用质量仍较好，而保存在室温的RNA则最好在8h以内使用，超过8h之后，RNA的完整性则难以保证。

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