结球甘蓝离体下胚轴不定芽再生研究

李 贵，陶 鹏，李必元，王五宏，岳智臣，钟新民

(1.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2.南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京 210095)

结球甘蓝 (Brassica oleracea L.var.capitata L.)属十字花科芸薹属，是甘蓝 (Brassica oleracea L.)的一个亚种，起源于地中海沿岸［1］，是我国的主要蔬菜作物之一。近年来为了提高植物的抗病性和抗逆性，利用农杆菌介导的植物基因工程技术将目的基因导入，可在保持原有优良背景的基础上改良目标性状，为品种改良开辟了新的途径。植物外植体的离体培养，建立高频率的再生体系是基因转化技术中的关键环节。通常情况下，离体再生频率越高，转化频率也越高［2］。前人研究结果表明，植株外植体的高效再生与很多因素有关，不仅与植物生长调节剂的类型、浓度有关，还与外植体类型、基因型、生理状态及乙烯抑制剂的应用有关［3-5］。本试验在前人研究的基础上，以结球甘蓝强力50(QL50)和甘19CMS的下胚轴为外植体，研究不同激素配比、Ag+、外植体的生理状态 (苗龄)等对下胚轴外植体再生的影响，以建立高效的结球甘蓝下胚轴再生体系，为下一步的基因转化研究奠定基础。现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为结球甘蓝强力50和甘19CMS，均由浙江省农业科学院蔬菜研究所提供，取其无菌实生苗下胚轴为外植体。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗培养

将结球甘蓝的种子用清水冲洗干净，置于75%的酒精中浸泡0.5 min，用0.1%的HgCl2表面消毒3 min，最后用无菌水冲洗4次，接种于无激素的 MS(蔗糖30 mg·L-1+琼脂7 mg·L-1，pH为5.8)培养基上。于 (25±2)℃、光照强度1 800 lx，16 h光/8 h暗的光周期培养无菌苗。

1.2.2 不同激素组合试验

不同激素组合，设6-BA浓度0，1，2，3，4 mg·L-1，与 NAA 浓度 0，0.02，0.2，0.5，0.8 mg·L-1进行完全随机组合。在材料适宜苗龄时，切取0.5 cm长的下胚轴放入加有不同激素组合的MS(蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1)分化培养基中。用培养皿进行培养，每皿接种40个外植体，重复3次。培养20 d后，调查不定芽的生长情况。

1.2.3 AgNO3与激素组合试验

从上步试验出芽较好的激素组合再与不同浓度的 AgNO3(0，2，4，6，8，10 mg·L-1)设计组合进行外植体培养。AgNO3采用过滤灭菌。培养20～25 d统计不定芽分化率。1.2.4 苗龄试验

在筛选出来的出芽较好的培养基上接种取自不同苗龄 (3，6，9，12，15，18，21 d)的外植体。培养20～25 d统计不定芽分化率。

1.2.5 不定芽生根与植株移栽

当分化培养基中的不定芽长到2～3 cm时，切取后转入含不同生长素的1/2 MS培养基 (IBA 0.2，0.5 mg·L-1，NAA0.2，0.5 mg·L-1)中，待芽基部形成大量的毛根后，打开三角瓶口，炼苗4～5 d后取出小植株，洗净根部培养基，移栽到基质中，筛选适宜结球甘蓝生根的培养基。

1.3 不定芽再生频率与再生系数的计算

不定芽再生频率/%=(再生不定芽的外植体数/接种外植体总数) ×100;不定芽再生系数(单个外植体再生芽数)=外植体再生的不定芽总数/再生不定芽的外植体总数。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度对不定芽再生的影响

外植体接种于不同激素浓度的诱导培养基4～5 d后明显增大，大多数不定芽于接种后15～25 d之间产生，接种后1个月左右仍有极少数不定芽发生。细胞分裂素与生长素浓度的不同配比影响下胚轴诱导不定芽的频率，不同激素组合的再生频率结果 (表1)表明:6-BA和NAA对结球甘蓝不定芽的诱导都是必要的，在MS培养基上单独添加各种浓度的NAA或6-BA，其下胚轴外植体均不能再生不定芽，在不含任何激素的MS培养基上，也不能再生不定芽，大部分外植体在接种后15 d左右褐化死亡;在6-BA与NAA组合中，随着6-BA浓度的升高，2个品种的不定芽再生率和再生系数略有上升;在6-BA的浓度一定时，不定芽再生率随着NAA浓度的升高而降低，当NAA浓度高于0.5 mg·L-1时，不定芽再生率开始明显下降;在NAA浓度为0.02 mg·L-1的处理中，QL50下胚轴的再生频率随着6-BA浓度的增加相应增加，当6-BA的浓度为2 mg·L-1时，其下胚轴不定芽再生频率达到最高 (图 1中 A)，为 89.13，再生系数为7.17，单个外植体上再生的不定芽数最高可达24个 (图1中B);在 NAA浓度为0.2 mg·L-1，6-BA的浓度为2 mg·L-1的处理中，甘19CMS不定芽再生频率达到最高，为64.67，再生系数为5.8;在NAA浓度为0.8 mg·L-1的处理中，2种材料的下胚轴不定芽再生频率明显下降，且在切口处有大量的不定根长出，大部分外植体在接种后20 d左右黄化褐死，再生率极低。

表1 NAA与6-BA配合对结球甘蓝离体下胚轴不定芽再生的影响

2.2 AgNO3浓度对不定芽再生的影响

由表2可知，QL50在 9 d苗龄时，下胚轴在分化培养基MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA;甘19CMS在苗龄6 d时，下胚轴在分化培养基 MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中分别添加2，4，6，8，10 mg·L-1的 AgNO3后，外植体的不定芽再生率随AgNO3浓度的升高而升高后下降。当AgNO3浓度为6 mg·L-1时，外植体的不定芽再生率由原来不添加 AgNO3时的89.1%和64.7%分别增高到93.0%和70.9%，平均再生系数分别达到9.17和6.97，随AgNO3浓度的继续升高，不定芽再生频率和再生系数均下降，并发现AgNO3浓度过高，外植体切口处褐化，再生的畸形芽也多，随浓度变高，褐化现象越严重。说明适当浓度的AgNO3对子叶不定芽再生有显著的促进作用。

表2 AgNO3对结球甘蓝离体下胚轴不定芽再生的影响

2.3 苗龄对不定芽再生的影响

由表3可以看出，不同苗龄QL50下胚轴在分化培养基 MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA，甘19CMS下胚轴在分化培养基MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中，下胚轴的不定芽再生率随着苗龄增加均不断增加，QL50下胚轴在9 d苗龄时再生率最高，达到89.1%，甘19CMS在6 d苗龄时再生率最高，达到69.2%;随着苗龄的增加再生率均不断降低，当到了15 d苗龄时再生率极低，当苗龄21 d时再生频率基本为零，外植体全部褐化死亡。

表3 不同苗龄对结球甘蓝离体下胚轴不定芽再生的影响

2.4 不定芽的生根

由表4可知，再生的不定芽在含有0.5 mg·L-1NAA的培养基上生根效果最好，再生的主根较多 (图1中C)，而在含有0.5 mg·L-1IBA的培养基上再生的须根较多，再生的主根的数量很少(图1中D)。不定芽在生根培养基中20 d后可形成较多的不定根，此时获得完整的再生植株 (图1中E)。再生植株经驯化炼苗后移入营养钵中，套塑料袋保湿。1周后去袋，再培养15 d左右，移栽到大花钵中让其充分生长，直至现蕾、开花。

图1 QL50下胚轴再生系统的建立

表4 不同生长素对不定芽诱导生根的影响

3 小结与讨论

在植物离体培养中，外源细胞分裂素、生长素对不定芽的诱导和生长发育具有重要作用。一般认为，细胞分裂素与生长素质量浓度的适宜配比是植物不定芽分化的重要条件，细胞分裂素有利于芽的诱导分化，生长素有利于根的诱导分化，二者同时使用，质量浓度比值高时产生芽，质量浓度比值适中时可维持原组织生长而不发生分化［6-7］。十字花科芸薹属作物在无性繁殖时，添加一定质量浓度的外源激素能够促进外植体不定芽的分化［8］。在本试验中，诱导结球甘蓝下胚轴再生不定芽时，选用6-BA和NAA 2种激素，在适宜浓度配比时能诱导出大量的不定芽，在只含有6-BA或NAA的培养基中，外植体均不能诱导出不定芽，这说明在不定芽的诱导过程中，细胞分裂素和生长素都是必须的，并且要求适宜的激素配比才能高效的诱导外植体不定芽的产生。这与许念芳等［9-18］的试验结果一致。

植物细胞在离体培养过程中会产生乙烯，其过度积累会影响外植体的生长和不定芽的分化。据报导，在用外植体诱导不定芽的培养基中加入AgNO3可显著的提高芸薹属植物的植株再生频率［19-22］。本研究发现在培养基中添加AgNO3后，再生率可提高;但随着AgNO3浓度的继续升高，不定芽再生频率和再生系数均下降，并且试验中发现AgNO3浓度过高，外植体部分褐化，再生的畸形芽也多，浓度越高，褐化现象越严重。说明适当浓度的AgNO3对不定芽再生有促进作用，而较高浓度的AgNO3对不定芽再生具有一定的副作用，这与前人的研究结果相一致［23］。

外植体的生理状态对不定芽再生的影响较大，选用适宜苗龄的无菌苗外植体能够获得较高的再生频率。有研究表明，不同取材时期的甘蓝下胚轴，其不定芽的分化有较大的差别［24］。本研究的试验结果与此一致，当苗龄在6～9 d时，不定芽的分化频率最高;当苗龄在15 d时，不定芽的分化频率非常低;当苗龄21 d时不定芽的分化频率基本为零。

根系健壮是试管苗成为再生植株的重要保证。有研究表明［25］，在不定根形成过程中，生长素起着主要作用。本研究结果发现再生芽在含IBA和NAA 2种激素的培养基上均能生根，但是NAA处理中不定芽再生的根系主根明显要比IBA处理中的多，再生苗更容易成活。

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