奥曲肽联合NSAIDs对结肠癌细胞生长的影响及作用机制＊

孙振海， 杜寒松， 龙跃平， 李 颖， 张 庆

华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科，武汉 430022

结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率有增加的趋势。研究报道长期服用非甾体类抗炎药物（non－steroid anti－inflammatory drugs，NSAIDs）可以有效减少结直肠肿瘤的发病风险［1－4］。塞来昔布（Celecoxib）是一种高选择性环氧合酶－2（COX－2）抑制剂，其表现出来的抗肿瘤作用引起了众多学者的关注。但有研究表明，用Celecoxib 对胃癌细胞进行干预时，Celecoxib能诱导胃癌细胞产生未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），主要表现在UPR 的标志分子BiP（immunoglobulin heavy chain binding protein in pre－B cells）表达量上调，从而削弱Celecoxib 诱导肿瘤细胞凋亡的作用［5］。奥曲肽（octreotide，OCT）是一种人工合成的长效生长抑素类似物。其生物学活性明显强于天然生长抑素，且作用时间更加持久。大量临床和基础研究均表明，OCT 不仅能抑制多种内分泌激素分泌，而且具有抑制多种肿瘤细胞增殖的功能，很多临床实验已将其与其它化疗药物进行联用，观察其对传统化疗药物的协同作用［6－11］。但OCT 抑制肿瘤细胞生长的具体机制目前仍不太清楚。本研究拟将OCT 与Celecoxib联合应用，处理人结肠癌细胞SW480，观察OCT 能否增强Celecoxib的抗癌作用，并探讨其作用机制是否是通过抑制Celecoxib诱发的UPR 而实现的。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人结肠癌细胞SW480由本科室保存。兔抗人BiP单克隆抗体购自Epitomics公司。HRP标记的羊抗兔IgG 购自ProteinTech Group公司。鼠抗人β－actin单克隆抗体及HRP标记的羊抗鼠IgG 购自武汉博士德公司。CCK－8购自碧云天公司。PI及RnaseA 购自Sigma公司。Annexin Ⅴ－FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自Bender Medsystems公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。DMED 高糖培养液购自HyClone公司。Celecoxib购自武汉威顺达科技发展有限公司。OCT 由上海诺华贸易有限公司赠与。

1.2 细胞培养

细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，在37℃，5%CO2饱和湿度的条件下培养。细胞长至80%～90%融合时用于实验。

1.3 CCK－8检测细胞增殖

取对数生长期细胞100μL 接种于96孔板中，每孔5 000个细胞，贴壁生长12h，根据预实验结果拟采用下列药物浓度和分组：空白对照组，Celecoxib单药组（80μmol／L），联合用药组（80μmol／L Celecoxib分别加0.25、0.5、1、2mg／L OCT），OCT单药组（0.25、0.5、1、2 mg／L）。每组设3 个复孔。Celecoxib溶于DMSO 中，细胞培养液中DMSO 的浓度为0.1%。分别培养24、48、72h后，每孔加入CCK－8溶液5μL，2h后用酶标仪于450nm 波段测定其吸光度值。以各组细胞与空白对照组吸光度比值反映细胞相对增殖能力。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞接种于6 孔板中，每孔约3×105个细胞，贴壁生长24h后按上述1.3项分组加药，作用12h后，离心收集细胞，1 500r／min离心5min，弃培养液。用冷PBS 洗涤细胞2 次。用400μL 1×Binding buffer悬浮细胞，密度大约为1×106／mL。在细胞悬浮液中加入5μL AnnexinⅤ－FITC，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min。加入10μL PI后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5min。在1h内用流式细胞仪检测。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

同1.4项培养、干预和收集细胞。用PBS洗涤细胞1 次。用－20℃预冷的75%乙醇固定过夜。离心收集细胞，1 000r／min离心5min，PBS洗涤细胞1次，尽可能去除上清。加入1mL 预混的DNA染液，其中PI工作浓度为100μg／mL，RnaseA 工作浓度为20μg／mL。4℃避光反应30min即上机检测。

1.6 Western blot检测BiP蛋白表达

取对数生长期细胞接种于6 孔板中，每孔约3×105个细胞，贴壁生长24h 后，设空白对照组、Celecoxib单药组（20、40、60、80μmol／L）、联合用药组（80μmol／L Celecoxib 加0.25、0.5、1、2 mg／L OCT）作用12h后，离心收集细胞，加裂解液，4℃下14 000g离心5min，离心收集上清液，BCA 法测蛋白浓度，取每孔30μg 进行SDS－PAGE 电泳，转PVDF膜，5%用TBST 预混的脱脂奶粉封闭2h，加兔抗人BiP单克隆抗体，及鼠抗人β－actin单克隆抗体4℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，每次10 min，加入相应二抗室温孵育2h，TBST 洗涤3次，每次10min，采用化学发光法（ECL）显影。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 CCK－8检测细胞增殖能力

结果显示药物作用24h后，联合用药组细胞相对增殖能力较空白对照组和单药组明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。药物作用48h和72h后，通过显微镜观察发现Celecoxib单药组及联合用药组细胞基本无存活。与24h 结果相比，OCT 单药组随作用时间增加，细胞受抑制程度反而减轻，与空白对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪分析发现，联合用药后，细胞凋亡较Celecoxib单用明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），且小剂量的OCT 与Celecoxib联合作用，效果更显著。而OCT 单用细胞凋亡与空白对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 流式细胞仪测定细胞周期

用流式细胞仪分析样品中各细胞时相的比例发现，联合用药与Celecoxib单用相比S期下降（P＜0.05），G0G1期增加（P＜0.05），而G2M 期变化不明显（P＞0.05）。OCT 单用和Celecoxib单用与空白对照组相比S期下降（P＜0.05），G0G1期增加（P＜0.05），而G2M 期变化不明显（P ＞0.05），且Celecoxib单用较OCT 单用作用更显著（P ＜0.05）。见图3。

图1 各组细胞相对增殖力Fig.1 Cell relative proliferation in each group

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡Fig.2 Analysis of apoptosis by flow cytometry

图3 流式细胞仪检测细胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle by flow cytometry

2.4 Western blot检测BiP蛋白表达

Western blot检测BiP蛋白表达发现，随Celecoxib用量增加，BiP表达量逐渐增加。联合用药后BiP的表达量均较Celecoxib单用减少（图4）。

图4 Western blot分析BiP蛋白的表达量Fig.4 Western blot analysis of BiP protein expression

3 讨论

结肠癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，全世界每年新发病例大约50万，居西方国家癌症患者死亡率的第3 位［12］。在亚洲，结肠癌的患病率正在增加，许多亚洲国家包括中国、日本、韩国、新加坡，在过去的几十年中结肠癌的发生率增加了2～4倍［13］。目前除了早期患者通过手术治疗可以治愈之外，大部分患者就诊时已有淋巴结转移，因此术后通过系统的化疗提高生存率尤为重要，但现有的化疗方案并不能使已有转移的患者获得满意的生存率［12，14］。其重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，因此如何减轻肿瘤细胞的耐药性，探讨其耐药机制，提出新的化疗方案，是医学工作者共同努力的方向。

OCT 是一种人工合成的长效生长抑素类似物，有着广泛的作用。它主要通过5种表面受体来传递信号，发挥生物学活性［6］。其直接的抗肿瘤活性主要是通过生长抑素受体2来发挥作用，而间接的抗肿瘤活性是通过对多种生长激素的分泌抑制来发挥作用，但其具体的抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的机制目前仍不太清楚［7－9］。目前研究主要集中于对内分泌肿瘤的治疗上，如脑垂体瘤引起的肢端肥大症、肾上腺亢进等［7－9］。另有研究发现它能促进胆囊癌和胃癌细胞凋亡，并抑制其增殖［10－11］。

近年来流行病学研究表明长期服用NSAIDs可降低癌症的发生率和死亡率，同时临床前和临床研究也表明一些NSAIDs能作为有效的化疗药物治疗肿瘤，特别是消化道肿瘤如胃癌、结肠癌和直肠癌等［1－4］。研究报道NSAIDs的抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞COX 的表达来诱导肿瘤细胞凋亡，然而一系列研究结果表明NSAIDs诱导细胞凋亡也存在非COX 依赖机制［5，15－17］。和其他化疗药物一样，肿瘤细胞对NSAIDs的耐药性也是其治疗肿瘤的主要障碍之一。研究表明，用Celecoxib 对消化道肿瘤进行化疗时，Celecoxib能诱导肿瘤细胞产生UPR，从而削弱Celecoxib 诱导肿瘤细胞凋亡的作用［5］。

UPR 是由于氧化应激、化学毒性、钙离子耗竭、缺氧等刺激造成内质网内未折叠或错误折叠的蛋白大量蓄积进而影响内质网微环境，触发内质网应激，引起一系列信号转导，最终导致一系列基因的转录活化，产生一系列复杂的生物学效应［18－20］。其最终结果取决于内质网应激的程度，首先通过适应性调节和抗凋亡通路使细胞得以生存，当适应性调节失败，不能维持细胞的正常功能时，便通过启动细胞死亡程序使细胞死亡［18－20］。

BiP也称GRP78（78－kD glucose－regulated protein），属于热休克蛋白HSP70亚家族，它是一种钙离子结合分子伴侣，主要定位于内质网中，是UPR激活的标志性分子［21］。当各种应激导致内质网中的蛋白折叠受到干扰而不能完全正常进行时，BiP的表达量就会被上调，随后BiP 会结合到错误折叠的蛋白，以避免这些蛋白形成聚集物，并促进这些蛋白的正确折叠以维持细胞的正常功能［21］。因此BiP对于维持细胞稳态和防止细胞凋亡具有重要作用。

本实验通过联合应用OCT 与Celecoxib 对人结肠癌细胞SW480进行干预后发现，二者联合应用对肿瘤细胞的增殖抑制作用强于两者单独应用。Celecoxib单用强于OCT 单用，并随作用时间延长效果加强。而OCT 的作用随时间延长效果反而相对减弱，说明OCT 的短期应用效果显著，长期作用似乎因耐受而减弱。这与Wang等［10］的研究有些不一致。通过对凋亡率的检测发现，联合用药使得肿瘤细胞的凋亡率增加，而单用OCT 并不能增加肿瘤细胞的凋亡率，反而有轻微的下降，但差异并不具有统计学意义。同时发现Celecoxib与小剂量的OCT 联合应用后细胞凋亡率的增加更加明显。通过以上研究结果可知，两药联合应用确实能有效增强Celecoxib的抗肿瘤效果。通过对UPR 的标志分子BiP的研究发现，Celecoxib作用于肿瘤细胞后能使BiP的表达量增加，这与Tsutsumi等［5］的研究结果一致。联合应用OCT 后，BiP 的表达量下降，这与凋亡率增加的结果相反，证明OCT 能抑制UPR 的发生，进而减轻肿瘤细胞的耐药性，增强肿瘤细胞对Celecoxib的敏感性。但OCT 对Celecoxib的正协同作用是否直接依赖于对UPR 的抑制还需进一步的研究。

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