反义寡核苷酸对血管瘤内皮细胞VEGF表达的影响＊

雷水生， 邓 镇， 朱晓琴， 朱 璐， 张远红， 唐晓丹， 孙 丹， 刘光敏

广州医学院 1 第五附属医院皮肤科，2 生理学教研室，广州 510700

血管瘤以内皮细胞过度增生和高表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）为特征，VEGF 是目前已知的20多种血管生长因子中重要的促血管生成因子，也是治疗肿瘤的理想靶点之一［1－2］。反义寡核苷酸（AS－ODN）药物是一类作为肿瘤基因治疗的较有前途的新型药物［3－4］。笔者前期研究发现，应用VEGF AS－ODN能显著抑制皮肤血管瘤内皮细胞的增殖［5］。为了进一步研究其作用机制，本研究将采用RT－PCR 法和ELISA 法检测血管内皮生长因子反义寡核苷酸（VEGF AS－ODN）作用后皮肤血管瘤内皮细胞VEGF mRNA 的表达及培养上清液中VEGF 蛋白分泌的改变，以期为皮肤血管瘤的发病机制和临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

血管瘤组织标本来源于广州市第八人民医院皮肤科，要求患者年龄在6 个月以内，肿瘤处在增生期，术前未进行任何治疗。细胞培养用M199 和RPMI 1640 培养液购于美国Gibco公司。胎牛血清购于Hyclone公司。阳离子脂质体、寡核苷酸、Trizol及逆转录试剂盒等试剂购于上海生工生物工程公司。

1.2 细胞培养及鉴定

无菌条件下将分离的皮肤血管瘤组织剪碎成1 mm×1mm×1mm 大小，接种于含M199的培养液中，置于5%CO2、37℃培养箱中。48h后更换RPMI 1640培养液，以后每隔3～4d更换1次培养液，待细胞汇合成片铺满瓶底即可传代。

血管瘤内皮细胞的鉴定：制成细胞爬片后采用血管内皮细胞标记物vWF（von Will brand factor）按SP 法进行染色，方法按试剂盒说明书操作。实验时取对数生长期细胞，经0.4%锥虫蓝拒染法检测活细胞率＞95%。

1.3 寡核苷酸的设计和合成

根据计算机程序模拟设计出互补于VEGF mRNA 的反义片段，用391A DNA 合成仪合成，PAGE电泳纯化，作用于VEGF 第3外显子（E3），并同时针对反义的片段分别合成正义和错义寡核苷酸片段。所有寡核苷酸链全硫代磷酸化修饰，由上海生工生物工程有限公司合成，冻干粉保存备用。AS－ODN 序列为：5′－GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC－3′；S－ODN 序列为：5′－CTATCAGCGCAGCTACTGC－3′；M－ODN 序列为：5′－CCTCGTCATGAGACACGTC－3′；M－ODN 经基因库检索与任何已知的人类基因无同源性。

1.4 实验分组与寡核苷酸导入

1.4.1 溶液配制 无菌条件下配置A 液、B液和C液。A 液：无血清无抗生素培养液适量溶解ASODN、S－ODN、M－ODN，室温下静置30 min；B 液：脂质体加入适量无血清无抗生素培养液中，放置5～10min；C液：将A 液与B 液轻轻混合，室温孵育15～20min。

1.4.2 实验分组 实验分为4组：AS－ODN 组、SODN 组、M－ODN 组、空白对照组。各个处理组设0、2.5、5.0、10.0、15.0μmol／L 5 个浓度。对照组和处理组各个浓度设5个复孔。培养6h细胞贴壁后行3条寡核苷酸链脂质体携带转运，无血清阻断4h后，恢复10%（体积分数）胎牛血清培养条件。转染后48h［5］收集细胞进行后续实验。

1.5 转染后RT－PCR进行皮肤血管瘤内皮细胞VEGF mRNA的定量分析

离心收集各组细胞沉淀，用PBS 洗涤细胞3次，Trizol法提取细胞总RNA，操作按照说明书进行。紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析RNA的纯度及浓度。取5μL RNA 用于逆转录，方法按试剂盒说明书进行。引物设计方法参照文献［6－7］。所有引物由上海生工合成、纯化。设计的VEGF 引物可以检测到VEGF 的2 种分泌型异构体：VEGF121 （NM 003376）和 VEGF165 （NM 003376）。经过RT－PCR 扩增后VEGF121 扩增产物长度为516bp，VEGF165长度为648bp。GAPDH（NM 017008）长度为208bp。分别取逆转录产物2.5μL 用于PCR，25μL 体系包括10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol／L dNTP mix 1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA polymerase 0.5μL，模板cDNA 2.5μL，高压灭菌蒸馏水16.5μL。VEGF PCR 条件：94℃预变性3 min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1 min，30 次循环后72℃延伸10min。取PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶（EB）染色后对电泳条带进行扫描分析，计算VEGF与GAPDH 的比值作为VEGF 表达水平参数，对VEGF PCR 产物进行相对定量。

1.6 ELISA法检测血管瘤内皮细胞VEGF蛋白分泌的改变

分别收集细胞培养上清及细胞，将所收细胞悬浮于PBS，并超声裂解细胞，将细胞裂解液于4℃，800r／min离心10min 后取上清检测，0.45μm 微孔滤膜过滤，－20℃冻存；设计酶标板布局，建立标准曲线；严格按照VEGF ELISA 试剂盒操作要求依次加样、孵育、洗板、加酶标抗体、孵育、洗板、加底物、孵育、终止反应、酶标仪比色等过程。检测皮肤血管瘤内皮细胞培养上清液中VEGF 蛋白分泌水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 AS－ODN 作用于血管瘤内皮细胞后VEGF mRNA 表达的改变

RT－PCR 结果（图1）显示，皮肤血管瘤内皮细胞表达516bp（VEGF121）和648bp（VEGF165）2个片段，主要以VEGF121 表达为主。电泳图像显示5.0μmol／L的AS－ODN 作用48h后，血管瘤内皮细胞VEGF 516bp条带丰度较空白组减弱，648 bp条带消失，而S－ODN 组、M－ODN 处理组VEGF条带未见明显改变。

定量分析 VEGF 121 电泳图像（AVEGF／AGAPDH），AS－ODN 组血管瘤内皮细胞VEGF121 mRNA 相对表达水平较空白对照组明显下降（P＜0.05）。而S－ODN 组、M－ODN 处理组与空白对照组比较，其VEGF121 mRNA 表达未见明显改变（均P＞0.05）。由于本身弱表达的VEGF165经低浓度AS－ODN（5.0μmol／L）作用后648bp 条带消失，故未对VEGF165 图像扫描吸光度值进行分析（表1）。

在相同的作用时间（48h）下，经不同浓度ASODN（2.5～15.0μmol／L）作用后，血管瘤内皮细胞VEGF121mRNA 表达量（A 值）呈剂量依赖性减少（表2）。

图1 5.0μmol／L各组寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后内皮细胞VEGF mRNA 的表达Fig.1 The expression level of VEGF mRNA in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h

2.2 AS－ODN 作用后血管瘤内皮细胞VEGF蛋白分泌的改变

ELISA 法检测结果显示，皮肤血管瘤内皮细胞分别经5.0μmol／L 寡核苷酸作用48h 后，其中AS－ODN 处理组血管瘤内皮细胞培养上清液中的VEGF浓度均较S－ODN 组、M－ODN 组和空白组明显降低，而S－ODN 组、M－ODN 组细胞培养上清中VEGF 浓度未见明显变化（表1）。

在相同的处理时间（48h），随着加入AS－ODN浓度的增高，血管瘤内皮细胞上清液中VEGF蛋白的分泌量逐渐降低，当加入浓度为5.0μmol／L 的AS－ODN 作用血管瘤内皮细胞48h 时，分泌到细胞培养上清液中的VEGF 浓度仅为空白对照组细胞的1／2（表2）。

3 讨论

血管瘤是以血管内皮细胞活跃增殖为特征的胚胎良性肿瘤，血管内皮细胞和血管新生在血管瘤病理演变过程中起重要作用［8］，血管的新生是由于血管内皮细胞在VEGF等许多细胞因子的诱导下，发生增殖和迁移，形成血管瘤［9－10］，内皮细胞过度增殖，血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点。

表1 5.0μmol／L各组寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后对血管瘤内皮细胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表达的影响（±s，n＝5）Table 1 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h（±s，n＝5）

表1 5.0μmol／L各组寡核苷酸（SP－ODN）作用48h 后对血管瘤内皮细胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表达的影响（±s，n＝5）Table 1 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with 5.0μmol／L SP－ODN for 48h（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.control group

GroupsVEGF mRNA（AVEGF／AGAPDH）VEGF protein（pg／mL）S－ODN 1.9±1.4 122.3±17.5 M－ODN 2.1±1.1 119.3±12.7 AS－ODN 0.5±0.1＊67.3±10.3＊Control 2.2±1.3 125.3.±17.6

表2 不同浓度AS－ODN 作用48h 后对血管瘤内皮细胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表达的影响（±s，n＝5）Table 2 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with different concentrations of VEGF AS－ODN for 48h（±s，n＝5）

表2 不同浓度AS－ODN 作用48h 后对血管瘤内皮细胞VEGF mRNA 及VEGF蛋白表达的影响（±s，n＝5）Table 2 The expression level of VEGF mRNA and protein in cultured skin hemangioma endothelial cells after treatment with different concentrations of VEGF AS－ODN for 48h（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L）

AS－ODN（μmol／L）VEGF mRNA（AVEGF／AGAPDH）VEGF protein（pg／mL）0 2.1±1.3 134.3±12.1 2.5 1.8±1.1 101.4±11.6 5.0 0.5±0.3＊67.1±9.3＊10.0 0.4±0.4＊58.8±8.7＊15.0 0.3±0.2＊52.2±8.5＊

VEGF是目前所知作用最强的一种促血管生长因子，是新生血管形成的中心调控因子和血管内皮细胞特异的有丝分裂原［11］。VEGF 具有5 种分子类型（VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206），是由不同的外显子剪切编码产生。VEGF121为可溶性分泌蛋白，VEGF165 有50%以可溶性形式分泌到胞外，其余部分和细胞膜或基膜上肝素结合，VEGF189和VEGF206几乎完全与细胞膜上的肝素分子结合，当机体需要时，通过蛋白水解酶的调节作用，使其释放出来［12］。目前，VEGF及其受体成为抗血管生成治疗肿瘤的理想靶点。其治疗途径主要为以下3 方面：①抑制VEGF 的释放；②中和刚释放出的VEGF；③阻断VEGF与血管内皮细胞上VEGFR 的结合，其中抑制VEGF 分泌已成为抗肿瘤血管新生的主要治疗手段［13］。

反义寡核苷酸（AS－ODN）药物现已被作为肿瘤基因治疗一类较有前途的新型药物［14－15］，其作用原理是通过碱基配对的原则与靶mRNA 结合，形成RNA－DNA 双螺旋结构，激活RNaseH，使靶RNA分子断裂而失去功能，从而特异性抑制靶基因编码的蛋白表达［16］。近来研究发现VEGF AS－ODN 不仅能够下调体外培养的乳腺癌和视网膜色素上皮细胞VEGF表达，而且能够抑制体内乳腺癌和眼脉络膜的血管新生［17－18］。文献报道VEGF AS－ODN 已成功用于抑制黑色素瘤、Kaposi肉瘤［7，19］。

前期研究发现，AS－ODN 对内皮细胞生长有抑制作用，且这种增殖抑制作用呈严格的核苷酸序列依赖性、剂量依赖性和时间依赖性，并提示VEGF AS－ODN 抑制了VEGF 基因的表达［5］。为了更进一步研究其作用途径，本研究采用RT－PCR，半定量测定各组皮肤血管瘤内皮细胞中VEGF mRNA 含量的变化，ELISA 检测各组皮肤血管瘤内皮细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌的改变。结果显示，皮肤血管瘤内皮细胞表达516bp（VEGF121）和648 bp（VEGF165）2个片段，主要以VEGF121表达为主。VEGF121 mRNA 相对表达水平明显下降，且呈剂量依赖性减少，可见VEGF AS－ODN 能够特异性抑制VEGF mRNA 表达。另外，ELISA 结果也显示，VEGF AS－ODN 作用后，血管瘤内皮细胞VEGF 蛋白的表达和分泌下降，随着加入VEGF AS－ODN 浓度的增高，血管瘤内皮细胞上清液中VEGF蛋白的分泌量逐渐降低，表明血管瘤内皮细胞中的VEGF 可能以分泌型蛋白为主，这与RTPCR 检测出血管瘤细胞主要表达VEGF121（516 bp）和VEGF165（648bp）2种mRNA 片段的结果相符。进一步证实了VEGF AS－ODN 通过减少血管瘤内皮细胞分泌型VEGF蛋白的表达和分泌，抑制血管内皮细胞的生长，从而发挥抗血管新生作用。

尽管VEGF AS－ODN 在肿瘤基因治疗中取得了一定的疗效，但也存在着明显的不足，AS－ODN不能与所有的VEGF mRNA 结合，即其抑制作用并不完全。而且肿瘤的血管形成受多种细胞因子的调节，单一抑制VEGF的表达并不能达到完全抑制肿瘤血管形成的目的。另外，抗血管生成只能抑制肿瘤的生长与转移，不能达到消灭肿瘤细胞的目的［20］，因此，合理利用反义核酸技术改变皮肤血管瘤内皮细胞增殖的生物学行为，同时联合其他传统治疗手段，是血管瘤基因治疗的一个重要方向，值得进一步研究探索。

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