HPLC-ESI-MS/MS 分析姜黄中姜黄素类化合物

蒋建兰 ，靳晓丽，乔 斌，元英进

系统生物工程教育部重点实验室天津市生物与制药工程重点实验室天津大学化工学院制药工程系，天津300072

姜黄为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，被广泛用于食品调料、着色剂以及中药，药理研究表明具有抗肿瘤、消炎、抗氧化、抗艾滋病、抗老年痴呆、降血脂等作用［1-3］。1985 年Kuttan 等［4］首次提出姜黄与姜黄素具有抗肿瘤活性。此后，有关这方面研究逐渐成为国内外医学界研究的热点。其中姜黄素已被美国国家癌症研究所(NCI)列为第三代防癌药物［5］。姜黄主要抗肿瘤活性成分为姜黄素类化合物［6-8］。其中姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素是最常见的3 种化合物，此外，姜黄属植物中还含有许多微量的姜黄素类化合物，许多研究表明这些微量成分与3 个常见成分有着相似甚至更好的药理活性［9-13］。现已从姜黄中发现了28种姜黄素类化合物，吴宏伟等［14］将这28 种化合物归纳为12 种母核和4 种取代基的组合。

目前，许多检测方法都已用于姜黄素类化合物研究，主要有液质联用［15-21］、薄层色谱［22，23］、毛细管电泳［24］等，大多研究主要分析姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素3 种常见化合物，少有文献报道分析其它微量姜黄素类化合物。李伟等［15］利用ESI 离子源，正离子模式扫描，在多反应监测模式(MRM)下对目标成分进行定性分析，建立了HPLCESI-MS/MS 分析方法。利用质谱碎裂规律，分别对每个目标成分同时监测8 个母离子/特征子离子对的反应过程，从姜黄中检测出6 种姜黄素类化合物。Hongliang Jiang 等［20］用ESI 离子源，正负两种扫描模式，结合DAD 检测模式，建立了姜黄LC-ESI-MS/MS 分析方法，共检测出19 种姜黄素类化合物。

本文通过色谱质谱条件的优化，利用HPLCESI-MS-MS 方法从姜黄中同时检出28 种姜黄素类化合物(见表1)，其中20 种化合物与文献报道一致［9，10，15，20］，另外8 种化合物笔者尚未见从姜黄中报道，并解析了它们的二级质谱断裂规律。本文为更加全面研究姜黄中姜黄素类化合物提供参考。

表1 姜黄中鉴别出的姜黄素类化合物Table 1 Curcuminoids identified in Curcuma longa L.

母核和取代基Mother nuclears and substituents

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪:美国热电集团Finnigan Surveyor 液相系统;Finnigan 离子阱质谱仪，型号为LCQ Deca XP MAX;

乙腈(色谱纯，美国Merck 公司)，甲醇(色谱纯，美国Merck 公司)，甲酸(美国fluka)，Millipore超纯水。

姜黄素(20100318)、去甲氧基姜黄素(20100318)、双去甲氧基姜黄素(20100318)对照品购于鼎瑞化工(上海)有限公司;

姜黄根茎(20100301)购于河北安国，由天津药物研究院张铁军研究员鉴定为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎。

1.2 对照品溶液的配制

分别准确称取适量姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素对照品，用甲醇溶解并定容至10 mL 的容量瓶中，于4 ℃下保存待用。

1.3 色谱条件

色谱柱:Venusil XBP C18(2. 1 ×150mm，5μm，Agela Technologies)。流动相:A 相为水(0. 1% 甲酸)，B 相为乙腈(0.1%甲酸)。梯度洗脱条件:0～2 min，10%B-10%B;2～57 min，10%B-100%B;57～60 min，100%B-100%B。柱温:30 ℃;进样量:5 μL;流速:0.2 mL/min。

1.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI);正负离子同时扫描;Full Scan;喷雾电压4.5 kV;毛细管温度350 ℃;吹扫气压力10 arb;辅助气流速40 arb;质量扫描范围:正离子为m/z 100～1000，负离子为m/z 150～1000;二级质谱碰撞能量(CID):35 eV。

1.5 样品前处理

首先将姜黄粉碎，过40 目筛，准确称量约50 mg 的姜黄粉末置于1000 mL 具塞锥形瓶中，加入500 mL 无水甲醇，混匀，超声萃取45 min，过滤并收集滤液，50 ℃水浴旋转蒸发至无液体蒸出，将剩余的稠状液体转移至离心管，15000 rpm 离心10 min，吸取离心后的稠状液体约1 mL 并用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，以0.22 μm 微孔滤膜过滤，滤液供分析。

图1 负离子模式(a)和正离子模式(b)下的总离子流图Fig.1 Total ion current (TIC)chromatograms from negative ion mode(a)and positive ion mode(b)

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱分离条件的优化

HPLC-ESI-MS-MS 具有灵敏度高、抗干扰能力强、样品前处理简单的特点，是分析中药、鉴定中药复杂体系的首选方法。本文通过对比其他类型的色谱柱，最终采用通用型、非极性且具有广泛pH 适用范围(1.5～10.0)的Venusil XBP C18型色谱柱，它适用于各类非极性、极性化合物，稳定性好，酸或碱性流动相下都有较好的使用寿命;采用常用流动相体系乙腈-水，因姜黄素类化合物含有酚羟基，易出现色谱峰拖尾，为了改善峰形，经对比试验在流动相中添加0.1%甲酸效果最好。调节流动相洗脱程序确定了梯度条件，得到了优化的色谱分离效果，正、负总离子流图，见图1。

图2 姜黄素类化合物的正离子二级图谱(左)和负离子二级图谱(右)Fig.2 Positive ion (+)ESI/MS/MS (left)and negative ion (-)ESI/MS/MS (right)of curcuminoids

姜黄素类化合物大都含有酚羟基，在负离子模式下此类化合物比较容易电离，但对样品中含量过低的化合物不够敏感，而正离子模式对微量化合物灵敏度较高，特别是含有O 和N 原子的物质更是易质子化而被检测出来［15］。本文以姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素作为目标物质，在正负离子两种模式下进行母离子全扫描，优化毛细管温度、喷雾电压、吹扫气压力、鞘气流速等参数，得到目标物质最强的准分子离子峰。然后对选定的母离子进行子离子扫描，优化碰撞能量等参数，在优化的条件下得到目标物质的二级质谱图，其中笔者未见文献报道的8 种化合物的二级质谱图见图2。

2.2 姜黄素类化合物的质谱解析

姜黄素类化合物在正离子模式下准分子离子峰为［M +H］+，负离子模式下准分子离子峰主要是［M–H］–，除此还有少量的［M–H+HCOOH］–。采用提取离子流(EIC)方式找到了28 个明显特征峰，根据谱峰的保留时间和质谱一、二级离子碎片信息，并结合对照品及参考文献信息，进行色谱峰的化合物归属分析。姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素3 种物质通过与对照品的色谱质谱数据对比确定，其它25 种化合物通过与这3 种常见姜黄素类化合物的色谱质谱数据以及二级断裂方式的比较中推测鉴定。这28种化合物中有20 种与文献报道一致［9，10，15，20］，包含双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素(化合物23、24 和25)。其它8 种物质解析如下:

化合物2:3，5-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羟基苯基)-庚烷。

(–)ESI-MS 检测到准分子离子［M – H］–为m/z 361，保留时间为17.23 min，观察它的二级质谱图，发现碎片比较少，母离子很难被打碎，推测此种物质缺少氧化性基团而不易碎裂，从保留时间和二级质谱碎片信息初步推断与化合物1，7-bis(4-hydroxyphenyl)-3，5-heptanediol 为同一系列物质(母核骨架为庚烷-3，5-二醇)［20］，分子量相差46，推测比文献化合物多一个羟基和一个甲氧基，初步推断为3，5-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羟基苯基)-庚烷。分析二级质谱图，m/z 361 准分子离子峰产生了m/z 179、165、223、209 共4 个主要二级碎片，在电喷雾电离过程中，羟基碳和临碳之间容易断裂，分别失去一个中性分子得到碎片m/z 179、165、223、209。根据裂解方式可以推测该化合物即为3，5-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羟基苯基)-庚烷。该化合物含有较多羟基，对负离子检测模式比较敏感(见图2 和图3)。

图3 化合物2 在负离子模式下的二级碎片Fig.3 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 2

化合物10:1-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。

(+)ESI-MS 检测到准分子离子［M + H］+为m/z 383，保留时间为22.32 min，初步推断与化合物8 和9 为同一系列化合物(母核骨架为1，4，6-庚三烯-3-酮)，分子量比9 多30，即多一个甲氧基，初步推断为1-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。分析二级质谱图，m/z 383 准分子离子峰没有产生碎片，在电喷雾电离过程中，因为存在三个双键的共轭结构，母离子很难被打碎，推测确实是同一系列物质。

化合物11 和12:环双去甲氧基姜黄素、环去甲氧基姜黄素。

检测到准分子离子峰［M + H］+分别为m/z 309、339;［M–H］–分别为m/z 307、337，保留时间分别为22.95 min 和23.31 min，二级碎片和双去甲氧基姜黄素(23)、去甲氧基姜黄素(24)的二级图谱几乎相同，虽然保留时间不同，但二级断裂方式基本一致，推测它们为同分异构体，已有文献报道姜黄中存在环姜黄素［10］，它是姜黄素的同分异构体，推测化合物13 为环姜黄素，故化合物11 和12 分别推测为环双去甲氧基姜黄素、环去甲氧基姜黄素。

化合物15、16 和17:结构暂未推断。

检测到准分子离子峰［M + H］+分别为m/z 293、323、353，保留时间分别为26. 91 min、27. 61 min、28.16 min，二级碎片分别为m/z 199、225;m/z 229、255;m/z 259、285。分子量和二级碎片均相差30(一个甲氧基)，说明它们具有相同的断裂方式，推测为同一系列化合物，目前还没有推测出它们的具体结构。虽然文献中已有分子量为292 的姜黄素类化合物报道［25］，但它的结构和化合物8、9 是同一系列。

化合物19:1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羟基苯基)-庚烷-3，5-二酮。

(-)ESI-MS 检测到准分子离子［M-H］–为m/z 341，保留时间为30.74 min，推断与化合物18 为同一系列物质(母核骨架为庚烷-3，5-二酮)，分子量相差30，推测比化合物18 多一个甲氧基，初步推断为1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羟基苯基)-庚烷-3，5-二酮。分析二级质谱图，m/z 341 准分子离子峰产生了m/z 205、235、219 共3 个主要二级碎片，在电喷雾电离过程中:(1)发生重排反应，并失去一个中性分子，得到碎片m/z 205。(2)发生重排反应，并失去一个中性分子，得到碎片m/z 235。(3)通过氢转移失去一个中性分子，得到碎片m/z 219。根据裂解方式可以推测该化合物即为1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羟基苯基)-庚烷-3，5-二酮。因为含量低，(+)ESI-MS/MS 检测没有得到响应(见图2和4)。

图4 化合物19 在负离子模式下的二级碎片Fig.4 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 19

3 结论

本文应用HPLC-ESI-MS-MS 的方法，根据谱峰信息，并结合对照品和参考文献信息，同时检测出28 种姜黄素类化合物，根据母核骨架结构可以划分为几个系列，同一系列的化合物具有相同的断裂方式。姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素这3 种物质是通过与对照品对比鉴定的，以此为基础推测出其它25 种化合物，并细致分析了未见从姜黄中报道的8 种化合物的二级质谱碎裂规律。

由于姜黄中微量姜黄素类化合物的含量低，难以鉴别，而该方法比较明确的同时检测出28 种化合物，且灵敏度高、稳定性强、重复性良好，说明该方法可用于姜黄中姜黄素类化合物的检测，本文为姜黄中姜黄素类化合物的更加全面研究提供了参考。

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