丙戊酸对大鼠急性脊髓损伤后BDNF及NT-3表达的影响

李新枝

成都医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，四川成都 610083

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后由于神经元无法再生以及继发性损伤，造成运动和感觉功能障碍，严重影响患者生活质量，迄今为止尚无切实有效的治疗方法。近年来研究表明，丙戊酸（valproic acid，VPA）具有多方面的神经营养效应和神经保护作用[1]，而有关VPA对SCI的影响及机制的报道很少。研究证实，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神经营养素3（neurotrophin-3，NT-3）具有阻止神经元死亡和促进轴突再生的双重作用[2]。本研究通过探讨VPA对大鼠SCI后BDNF和NT-3表达的影响，为临床治疗SCI提供新方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康成年雄性SD大鼠60只，清洁级，体重250～300 g，由成都医学院实验动物中心提供。置实验室环境中饲养1周，自由摄食和饮水。

1.2 试剂

丙戊酸（购自杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司），兔抗大鼠BDNF一抗，兔抗大鼠NT-3一抗，SABC免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 脊髓损伤动物模型制作

大鼠术前12 h禁食，自由饮水。1%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔内注射麻醉后，采用改良的Allen法制作脊髓损伤动物模型：大鼠俯卧位固定，无菌条件下暴露T9～11椎板，咬除T10的棘突及椎板，以12.5 mm×10 g的能量撞击，金属杆下落后大鼠迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩扑动，表明撞击成功。对照组（C组）只做T10椎板切除术。

1.4 动物分组及处理

60只大鼠随机分为损伤组（SCI组）、丙戊酸保护组（VPA组）和C组，每组又分为伤后24、48、72 h和1周4个时间点，每个时间点5只大鼠。VPA组术后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C组和SCI组在相应时间点注射等体积的生理盐水。术后皮下注射青霉素（10 000 U/100 g）抗感染，SCI组大鼠给予人工排尿，每日2次。

1.5 BBB评分[3]

各组大鼠于术后24、48、72 h和1周行BBB评分。为保证评分的准确性，由3名非实验人员了解评分标准后，各自评分，取平均值。

1.6 取材及样品制备

大鼠采用1%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔内注射麻醉后行灌流固定，打开胸腔暴露心脏及主动脉根部，左心室插管至主动脉根部，剪开右心耳，灌注生理盐水约200 mL，至流出液体澄清，换用4%多聚甲醛灌注约300 mL 40min，灌流固定成功后，依次剪开动物背部皮肤、肌肉，暴露损伤段脊髓，以损伤段为中心，切取约1 cm的脊髓段，4%多聚甲醛后固定24 h，常规石蜡包埋，从损伤中心连续横切片，片厚5μm，备用。

1.7 脑源性神经营养因子和神经营养素3检测

切片常规脱蜡水化后，用SABC法进行免疫组织化学染色。以胞浆出现棕黄色颗粒作为阳性判断标准。光镜下（10×40）每张切片随机拍摄5个不重复的视野。用Image-Pro Plus（IPP）图像分析软件测量BDNF及NT-3免疫反应产物的平均吸光度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠BBB评分比较

C组各时间点运动功能均未受影响，评分均为21分，SCI组和VPA组的BBB评分在各时间点均显著下降，但VPA组的评分在各时间点高于SCI组，SCI后48、72 h和1周两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BBB评分比较（±s，分）

表1 各组大鼠BBB评分比较（±s，分）

注：与C组比较，*P＜0.05；与SCI组比较，#P＜0.05

组别 例数24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI组VPA组C组20 20 20 0.33±0.27*0.42±0.17*21 2.42±0.32*4.08±0.31*#21 4.50±0.43*7.67±0.54*#21 5.53±0.65*10.78±0.36*#21

2.2 三组大鼠脑源性神经营养因子和神经营养素3表达情况比较

C组各时间点BDNF和NT-3均有少量表达，BDNF阳性产物主要位于神经元胞浆内，NT-3阳性产物在神经元和胶质细胞胞浆内均可见。SCI组和VPA组在伤后24 h即可见BDNF和NT-3表达明显增加，BDNF的表达在伤后72 h达高峰，以后逐渐减少，1周时其表达水平仍明显高于C组（P＜0.05）。NT-3的表达在伤后1周达高峰。与SCI组相比，VPA组的BDNF和NT-3阳性表达在各时间点均明显增加（P＜0.05）。见表2、3。

表2 三组大鼠脑源性神经营养因子平均光密度比较（±s）

表2 三组大鼠脑源性神经营养因子平均光密度比较（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与SCI组比较，#P＜0.05

组别 例数24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI组VPA组C组20 20 20 118.24±11.13*167.04±8.86*#82.66±6.78 134.33±9.36*193.86±11.38*#80.24±4.53 168.35±9.27*212.76±10.04*#81.07±5.23 147.26±10.21*188.23±9.01*#82.76±6.84

表3 各组大鼠神经营养素3平均吸光度比较（±s）

表3 各组大鼠神经营养素3平均吸光度比较（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与SCI组比较，#P＜0.05

组别 例数24 h（n=5）48 h（n=5）72 h（n=5）1周（n=5）SCI组VPA组C组20 20 20 91.08±6.32*126.49±11.38*#65.24±6.75 97.81±7.95*139.27±10.49*#62.14±5.67 102.18±8.49*149.29±11.13*#66.39±6.51 127.83±9.27*168.18±9.36*#61.83±7.21

3 讨论

VPA是一种情绪稳定剂和抗癫痫剂，常用于双相性情绪障碍的治疗。近年来VPA的神经保护作用日益受到关注，研究发现，VPA具有阻断谷氨酸诱导的兴奋性中毒、减轻炎症反应、抑制脂质过氧化和蛋白质氧化、抗凋亡等效应，对帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病具有保护作用[4]。但VPA的神经保护作用机制目前尚不完全明确。神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）是机体产生的能支持神经元存活和促进轴突生长的一类蛋白质，包括神经营养素家族（NGF、BDNF、NT-3等）、胶质细胞源性神经营养因子家族、睫状神经营养因子家族和成纤维细胞生长因子家族。研究证实，NTFs对神经细胞的发生、发育、分化和再生起重要作用，对神经病和精神病均具有潜在治疗作用[5]。

SCI后的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指受伤即时由机械性损伤所造成的细胞坏死和出血。继发性损伤的机制还不完全清楚，目前已知的包括缺氧、缺血-再灌注、谷氨酸兴奋性中毒、氧化应激、自由基形成和炎症反应等，这一系列反应造成神经细胞进一步的坏死和凋亡。由于SCI后损伤局部缺乏NTFs以及存在轴突生长抑制因子等因素，造成神经细胞再生困难，因此，外源性补充NTFs或用药物促进神经细胞自身合成和分泌NTFs，将有助于患者神经功能恢复。Sasaki等[6]研究发现，BDNF基因修饰的间充质干细胞移植比单纯的间充质干细胞移植更能促进SCI后大鼠神经功能恢复和轴突生长，并且有助于损伤面积缩小，表明BDNF对SCI具有保护作用。Guo等[7]研究证实NT-3基因修饰的施万细胞与神经干细胞联合移植与单独移植神经干细胞相比，有更多的神经干细胞向神经元分化。本研究VPA组的BDNF和NT-3表达与SCI组相比在各时间点均明显增加，表明VPA可促进SCI后大鼠内源性的BDNF和NT-3表达。与本研究相似，Chen等[8]研究发现，VPA可刺激星形胶质细胞释放NTFs，从而保护受损的多巴胺能神经元。

本研究BBB评分显示，VPA组的评分在各时间点均高于SCI组，两者相比在伤后48、72 h和1周差异有显著性（P＜0.05），表明VPA可促进SCI后大鼠神经功能恢复，其机制可能与促进BDNF和NT-3表达相关。此外，笔者前期的研究表明，VPA可减少SCI后神经细胞凋亡，上调HSP 70表达[9]。另有研究发现，VPA通过促进内源性神经干细胞增殖从而对SCI发挥保护作用。最近有研究报道，VPA可抑制组蛋白脱乙酰基酶活性[10]，从而促进SCI后神经功能恢复。有关VPA对SCI保护作用的确切机制目前还不清楚，仍需进一步研究。

综上所述，VPA通过促进BDNF和NT-3表达，从而对SCI发挥保护作用。由于VPA具有多方面的神经保护作用，其有望成为临床治疗SCI的备选药物之一，因此有必要进一步深入探讨其对SCI保护作用及其机制。

[1]Penas C，VerdúE，Asensio PE，et al.Valproate reduces CHOP levels and preserves oligodendrocytes and axons after spinal cord injury[J].Neuroscience，2011，178：33-44.

[2]Jain A，McKeon RJ，Brady-Kalnay SM，et al.Sustained delivery of activated Rho GTPases and BDNF promotes axon growth in CSPG-rich regions following spinal cord injury[J].Plos One，2011，6（1）：16135.

[3]Bethea JR，Castro M，Keane RW，et al.Traumatic spinal cord injury induces nuclear factor-kb activation[J].J Neurosci，1998，18（9）：3251-3260.

[4]Monti B，Gatta V，Piretti F，et al.Valproic acid is neuroprotective in the rotenone rat model of Parkinson's disease：involvement of alpha-synuclein[J].Neurotox Res，2010，17（2）：130-141.

[5]Alan HN，Mark HT.Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric disorders[J].Nature Reviews Drug Discovery，2011，10：209-219.

[6]Sasaki M，Radtke C，Tan AM.BDNF-hypersecreting human mesenchymal stem cells promote functional recovery，axonal sprouting，and protection of corticospinal neurons after spinal cord injury[J].The Journal of Neuroscience，2009，29（47）：14932-14941.

[7]Guo JS，Zeng YS，Li HB，et al.Cotransplant of neural stem cells and NT-3 gene modified Schwann cells promote the recovery of transected spinal cord injury[J].Spinal Cord，2007，45（1）：15-24.

[8]Chen PS，Peng GS，Li G，et al.Valproate protects dopaminergic neurons in midbrain neuron/glia cultures by stimulating the release of neurotrophic factors from astrocytes[J].Molecular Psychiatry，2006，11：1116-1125.

[9]李新枝，聂政.丙戊酸对大鼠急性脊髓损伤的保护作用[J].中国康复医学杂志，2011，26（4）：347-350.

[10]LU L，Sun Y，Han X，et al.Valproic acid improves outcome after rodent spinal cord injury：potential roles of histone deacetylase inhibition[J].Brain Res，2011，1396：60-68.