小环肽C* HSDGIC* 对中波紫外线诱导的视网膜色素人上皮细胞凋亡的影响*

丁 勇， 程欢欢， 余榕捷， 陈建苏

(暨南大学1附属第一医院眼科，2 生物工程研究所，3 医学院眼科研究室，广东 广州510632)

垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase－activating polypeptide，PACAP)是具有多种重要生物学功能的神经肽，广泛分布在神经系统中，主要通过作用于其特异性受体PACAP 1 型受体(PACAP type 1 receptor，PAC1－R)来实现神经保护及修复的功能，这一作用已在视网膜上得到证实［1］。但PACAP 易被二基肽酶水解生成自身拮抗剂PACAP (6－27)或(6－38)［2］。PACAP 的N 端(His1－Ser2－Asp3－Gly4)是激活PAC1－R 的关键结构域［3］。而小环肽C*HSDGIC*(CHC)由PACAP N 端5 个氨基酸经二硫键环合而成，稳定性较PACAP 更强，是PAC1－R 的新型高效激动剂［4］。

在老年性黄斑变性(age－related macular degeneration，AMD)等慢性视网膜疾病中，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的损伤主要表现为细胞凋亡［5］。内源性色素水平增高和后极部眼底代谢活动增强使得黄斑易受光诱导的氧化应激损伤［6］。Youn 等［7］发现紫外线(ultraviolet，UV)照射能引起活性氧生成进而导致氧化性应激，诱导人RPE 细胞系ARPE－19 凋亡。而Mester 等［8］研究发现PACAP 对氧化应激诱导的ARPE－19 凋亡具有抑制作用。本实验旨在研究CHC 对中波紫外线(ultraviolet B，UVB)诱导的人RPE 细胞凋亡的影响，为RPE 相关病变的治疗提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 主要材料与试剂

CHC(暨南大学生物工程研究所余榕捷教授惠赠);兔源性多克隆PAC1－R 抗体(Santa Cruz);兔单克隆β－actin 抗体(Cell Signaling);山羊抗兔IgG 抗体(Santa Cruz);CCK－8 试剂盒(Donjindo);流式细胞仪(BD FACSAria TM);全波长多功能酶标仪(Tecan Safire2，Switzerland)。

2 方法

2.1 人RPE 细胞培养 RPE 细胞来源于本实验室存储，第2 ～7 代用于实验，用含10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 高糖培养基培养细胞，置于37 ℃、5% CO2培养箱内，3 ～5 d 传代。

2.2 CCK－8 法检测 人RPE 细胞按5 ×103cells/well 密度于96 孔板铺板，长至60%融合的细胞单层后加入不同浓度CHC，继续孵育24 h。另取RPE 细胞5 ×103cells/well 种于96 孔板，孵育24 h 后，撤去培养基，予0.2 J/cm2UVB (波长312 nm)照射，随后实验组加入含不同浓度CHC 的新鲜无血清培养基，对照组加入正常无血清培养基，继续培养24 h。每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培养2 h，用多功能酶标仪测定各孔在波长450 nm 的吸光度值(A)。实验重复3 次。

2.3 UVB 照射 紫外灯箱(Spectronics，EBF－260C)内进行照射，光源距样品垂直距离15 cm 时功率为330 μW/cm2。照射时弃培养基，照后加培养基继续培养。

2.4 Western blotting 检测 收集实验组及对照组1 ×106RPE 细胞裂解后的上清液，进行SDS－PAGE电泳，电转至PVDF 膜上，PVDF 膜浸入在5%封闭液，4 ℃振荡1 h，PVDF 膜与兔多克隆PAC1－R 抗体(1∶2 000)和兔单克隆β－actin 抗体(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，再与山羊抗兔IgG 抗体(1∶3 000)室温孵育1 h，ECL 法显色，显影剂孵育1 min，定影剂孵育0.5 min。

2.5 流式细胞仪检测 1 ×107/L 细胞密度种于6孔板，实验组、对照组细胞用0.25%胰蛋白酶消化3 min，收集细胞，PBS 吹散制备成单细胞悬液，收集5 ×105个细胞，Annexin V－FITC/PI 双染:200 μL binding buffer 加入细胞悬液中，再依次加入10 μL Annexin V－FITC、10 μL PI 轻轻混匀，JC－1 染色:加入200 μL JC－1 稀释液轻轻混匀，避光室温反应15 min，流式细胞仪上检测。

结 果

1 CCK－8 法检测结果

图1 显示，100 μmol/L CHC 明显增加人RPE 细胞活性，100 μmol/L CHC 组比对照组细胞活性增加(34.23±3.39)%，差异显著(P ＜0.05)。除1 nmol/L组外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 处理组与对照组比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。

Figure 1. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells determined by CCK－8 assay.±s. n=12. * P ＜0.05 vs control. CHC:C* HSDGIC* .图1 不同浓度CHC 对人RPE 细胞活性的影响

图2 显示，CHC 能抑制UVB 照射诱导的人RPE细胞活性降低，100 μmol/L 组细胞活性比UVB 组增高(20.10 ±1.48)%(P ＜0.05)。除1 nmol/L 组外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 处理均能使UVB 照射后细胞活性增加，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

Figure 2. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells after UVB irradiation determined by CCK－8 assay. ±s. n=12. * P ＜0.05 vs UVB.图2 不同浓度CHC 对UVB 照射后人RPE 细胞活性的影响

2 Western blotting 检测结果

图3 显示人RPE 细胞在正常状态下表达PAC1－R，经UVB 照射及CHC 处理后PAC1－R 表达水平发生改变。

3 流式细胞术检测细胞凋亡

Annexin V－FITC/PI 双染检测发现对照组活细胞比例为(93.67 ±0.43)%，早期和晚期凋亡细胞占(5.69 ±0.23)%。经0.2 J/cm2UVB 照射后凋亡细胞比例显著增加，而100 μmol/L CHC 处理后凋亡细胞总比例下降(5.63 ±1.49)% (P ＜0.05)，见图4。

Figure 3. Changes of PAC1 receptor (PAC1－R)protein level in human RPE cells treated with 0.2 J/cm2 UVB and in UVB and 100 μmol/L CHC co－treated RPE cells detected by Western blotting. ±s.n =3，* P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs UVB.图3 人RPE 细胞的PAC1－R 蛋白表达

Figure 4. Proportion of living，necrotic，early，and late apoptotic cells in untreated control cells，cells exposed to 0.2 J/cm2 UVB irradiation，and cells incubated with 100 μmol/L CHC after UVB treatment. Lower left quadrant:living cells;lower right quadrant:early apoptotic cells;upper left quadrant:necrotic cells;upper right quadrant:late apoptotic cells.图4 100 μmol/L CHC 对UVB 照射后RPE 细胞中凋亡细胞比例的影响

4 流式细胞术检测线粒体膜电位

JC－1 检测发现UVB 照射组低线粒体膜电位细胞比例显著增加，而CHC 处理后线粒体去极化细胞比例下降(5.2 ±0.5)% (P ＜0.05)，表明线粒体途径可能参与UVB 诱导的RPE 细胞凋亡，而CHC 能一定程度抑制线粒体膜电位降低，见图5。

讨 论

Figure 5. Effect of CHC (100 μmol/L)on mitochondral membrane potential of human RPE cells after UVB irradiation determined by flow cytometry with JC－1 staining. Lower right quadrant (Q4)indicates cells with mitochondrial depolarization.图5 100 μmol/L CHC 对UVB 照射后RPE 细胞线粒体膜电位的影响

作为视网膜的最外层，RPE 在胚胎学上来自形成感觉神经视网膜的神经管。尽管RPE 不直接参与视觉的神经发生，但对于光感受器的正常形态和功能起着关键作用［9］。RPE细胞的功能包括参与形成血－视网膜屏障，清除代谢废物，选择性转运物质至光感受器，加工维生素A，吞噬光感受器外节盘膜，促进光感受器更新等。作为AMD 重要的发病机制之一，光照损伤通过造成RPE 细胞功能障碍而最终导致AMD。大量研究已证明早期AMD(包括玻璃膜疣以及色素改变)与照射暴露之间有显著相关性［13］。因而本实验用紫外照射诱导凋亡，进而研究CHC 对RPE 细胞凋亡的影响，以期为AMD 的治疗提供新的思路。

在视网膜上，PAC1－R 占PACAP 受体总量的85%，并在神经节细胞层，内核层和无长突神经细胞中高表达［10］。Zhang 等［11］用PCR 技术在RPE 细胞上发现PAC1－R 的mRNA 表达。本实验用Western blotting 检测出RPE 细胞上PAC1－R 的蛋白表达。PAC1－R 通过作用于多种信号通路，如抑制线粒体凋亡通路，增加抗凋亡蛋白Bcl－2 表达和抑制caspase－3 活力来介导保护作用，其作用与上述通路开放有关，而非直接依赖于PAC1－R 表达水平［12］。PAC1－R 的高表达与组织衰老及细胞凋亡密切相关，例如PAC1－R 在老年大鼠的脑部表达水平随着年龄增加而显著升高，与脑部组织衰老程度成正比［15］，又有报道PAC1－R 在受到辐射及毒素损伤的胸腺中表达显著上调［16］，这与我们观察到的PAC1－R 在损伤的细胞中表达上调相吻合，表明PAC1－R 的表达与细胞损伤程度密切相关。UVB 照射后PAC1－R 表达代偿性升高，CHC 处理后PAC1－R代偿反应减弱，表明RPE 细胞损伤程度降低。PAC1－R 激动剂能增加多种细胞的活性，例如PAC1－R被证实存在于人诱导多能干细胞(IPSCs)上，其特异激动剂能促进IPSCs 增殖［14］。有研究证明PACAP具有促进RPE 细胞活性的作用，抑制炎症细胞因子的表达［11］，10 pmol/L ～1 μmol/L PACAP 能抑制H2O2诱导的ARPE－19 细胞凋亡［8］。本实验在UVB 照射后用1 nmol/L ～1 mmol/L CHC 培养RPE细胞24 h，观察CHC 对RPE 细胞的影响。结果发现10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 处理均能增加UVB 照射后的细胞活性，抑制凋亡，100 μmol/L CHC 作用最明显，证明CHC 具有和PACAP 类似的抗凋亡作用。

小环肽CHC 与PACAP 相比具有以下优势:(1)CHC 由激活PAC1 受体的关键结构域HSDGIC 两端添加半胱氨酸残基(Cys)经二硫键环合而成，结构更稳定，不易水解，不会成为自身拮抗剂［4］;(2)CHC结构简单，分子量小(700 D 左右)，极易穿越血管屏障和其它组织屏障，能更好作用于视网膜组织，在视网膜保护方面具有应用潜能。

综上，本实验发现人RPE 细胞存在PACAP 的特异受体PAC1－R 的蛋白表达，并证明由PACAP 衍生而来的小环肽C*HSDGIC*对人RPE 细胞具有促细胞活性和抗凋亡的作用。

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