结缔组织生长因子在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究

天津医科大学总医院 徐萧洪，宋作庆，李世彬

山东省千佛山医院 刘振3

泸州医学院 王文军5

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一， 80%以上的肿瘤患者死于肿瘤的侵袭和转移。有研究显示，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)可能在肿瘤生长和血管生成中起作用。肿瘤血管的生成为肿瘤的生长提供了充足的营养，加速了肿瘤的生长，而且为肿瘤细胞进入血液循环创造了极为有利的条件，成为促进肿瘤侵袭和转移的重要因素。本课题组采用免疫组织化学的方法检测了CTGF在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表达情况，并研究了CTGF表达与NSCLC临床病理特征之间的关系及意义。CTGF作为抑制肿瘤侵袭和转移的途径之一，为防治肿瘤转移提供了一个很有前途的新靶点。检测NSCLC患者CTGF的表达，对于手术治疗的范围的选择将具有参考价值，以减少不必要的扩大手术，减少患者的器官功能缺损，提高生活质量；监测术后CTGF的表达水平，将有望成为判断患者的复发、预后的一个新的指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象 标本选自泸州医学院附属医院胸外科2006年1月—2007年2月收治的肺癌患者手术后存档石蜡标本，50例患者均有完整的病理资料。所有患者术前均未接受放疗及化疗，术后均经组织病理学确诊，并取10例正常肺组织作为对照。

1.2 肿瘤患者资料 NSCLC患者50例，其中男性36例，女性14例；年龄13～76岁，平均年龄59.6岁；按UICC(1997年)制定的分期标准进行术后病理分期，I期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例。根据WHO标准分型，肺鳞癌20例，肺腺癌18例，混合癌(大细胞＋腺鳞癌)12例；其中伴淋巴结转移者35例，不伴淋巴结转移者15例；高分化癌13例，中分化癌20例，低分化癌17例。

1.3 检测方法及结果判定 采用免疫组织化学法(S-P法)，以PBS代替一抗作阴性对照。阳性结果判定：CTGF和TGF-β1蛋白表达主要在细胞质中，以棕黄色颗粒为阳性，不着色为阴性。判定标准：切片中阳性细胞率及染色反应强度作为分级标准。即阴性(-)为细胞质不着色或阳性细胞率＜10%；弱阳性(+)为细胞质内出现浅棕黄色颗粒和(或)阳性细胞率为10%～25%；阳性(++)为细胞浆内出现棕黄色颗粒和(或)阳性细胞率为26%～50%；强阳性(+++)为细胞浆内出现深棕黄色颗粒和(或)阳性细胞率＞51%。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 统计处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，四表格资料用Fish精确概率法、χ2检验法分析CTGF表达与临床病理指标的关系；等级资料的两样本比较用秩和检验，双变量资料的等级相关性用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTGF在NSCLC和正常肺组织中的表达情况的比较 CTGF主要定位于正常细胞的细胞质中，在NSCLC组织中的阳性表达率为32%(16/50)，10例正常肺组织中有9例CTGF呈阳性表达，二者差异有统计学意义(图1，P=0.001，χ2=11.534)。

2.2 CTGF表达与NSCLC临床病理特征的关系 CTGF在NSCLC组织中的阳性表达率为30%,CTGF表达水平与NSCLC患者性别、原发肿瘤大小、组织学类型、癌细胞分化程度均无相关性(P＞0.05)；而与临床分期及淋巴结转移有关 (P值分别为0.002和0.001)。在T N M分期中，其阳性表达率分别为Ⅰ～Ⅱ期(50%)；Ⅲ～Ⅳ期(9.09%)。Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期比较差异有统计意义。术后证实有淋巴结转移组中CTGF的阳性表达率为17.14%，淋巴结无转移组中CTGF的阳性表达率为66.67%，两组相比差异具有显著的统计学意义(P＜0.005)。(表1)

图1 CTGF在正常肺组织和癌组织中的表达情况

3 讨论

表1 CTGF表达与NSCLC临床病理因素的关系Table 1 Relationship between the expression of CTGF and the different clinicopathologic factors in NSCLC

目前肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，高发病率和低存活率使得肺癌成为肿瘤的主要死因。因此对肺癌的侵袭和转移的机理研究变得尤为重要。

CTGF是从人脐静脉内皮细胞cDNA文库中首次克隆到的，属生长因子CCN基因家族的亚家族成员。CTGF可以分泌细胞外基质联合蛋白，调节细胞生长过程，具有明显的有丝分裂原性和趋化性。近年有研究表明，CTGF表达与恶性肿瘤发生、进展、细胞外基质形成、转移及预后密切相关，肿瘤细胞自分泌的CTGF与相应受体或配体结合后能抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞外基质形成及抑制转移的发生。

本研究中发现，CTGF在NSCLC中为低表达，50例NSCLC标本中CTGF表达减弱，阳性率仅为30%，低于正常肺组织的70%。免疫学证实，其在正常的细支气管上皮组织中大量表达，而在肿瘤细胞却未见表达。这与以往报道[1]，CTGF在正常的乳腺上皮细胞内皮细胞和基质细胞呈高表达，而很少在乳腺癌细胞中表达的结果一致。

本研究结果显示，CTGF的表达率在有淋巴结转移者中显著低于无淋巴结转移者，在临床Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者中显著低于Ⅰ-Ⅱ期患者。而CTGF表达水平与NSCLC患者性别、原发肿瘤大小、组织学类型及癌细胞的分化程度均无相关性，所以CTGF表达水平的降低具有提示肿瘤转移的意义。如果能阐明CTGF在肺癌发展过程中的作用机制，可能会为肺癌的治疗寻找新的治疗靶点提供科学依据。笔者认为CTGF在肺癌中抑制肿瘤生长和转移的作用机制可能有以下原因：(1)内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是调节肿瘤伴随血管生成的主要细胞调节因子，可以促进肿瘤的生长和转移。有研究显示，CTGF可以和VEGF165相互作用形成复合物[2]，从而使CTGF抑制VEGF诱导的血管生成[3]，随后进一步抑制NSCLC血管的生成和转移。有实验证明CTGF对VEGF-A基因表达的影响是通过ARD-1 (arrestdefective 1)依赖的乙酰化加速HIF-1α蛋白降解介导的[4]。由此可以说CTGF是一个血管生成的抑制剂，抑制肺腺癌的血管生成和转移。(2)过表达的CTGF在诱导细胞周期停滞在G0/G1期的同时伴随对p53h和p14 [ADP ribosylation factor (ARF)]的诱导。ARF可以调节p53的水平，对抗MDM2并保护p53不被降解[5,6]。在成纤维细胞中，ARF是通过p53诱导细胞周期停滞在G1和G2期。ARF在NSCLC中经常被灭活或不表达[7-9]。本结果表明，CTGF的表达可以增加ARF的表达水平, ARF不能通过DNA损伤剂激活。未调节的E2F1活性能诱导ARF蛋白表达，并依次稳定p53，导致细胞周期停滞及防止不受控制的细胞增殖。

已知C T G F蛋白包含一个胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)结合蛋白区域。IGF-I依赖的Akt磷酸化和EGF依赖的ERK1/2磷酸化可以被CTGF过量表达而抑制[10]。以往的研究表明，在乳腺癌中WISP3(CCN6)可以调节IGF-I受体信号通过和IGF-1的相互作用[11]。相同的理论对于CTGF，尽管研究证明CTGF对IFG-1有相对低的亲和力。Akt和p53通路形成一个反馈回路，Akt活化导致MDM2磷酸化，最终引起p53的灭活，反之，p53的活化也可以抑制Akt的作用[12]。CTGF的表达可以影响p53通路的这种相互干扰，同时抑制Akt通路。这些细胞的生长停滞可能是由CTGF通过E2F1和ARF诱导p53表达引起的。研究发现，CTGF可以通过一种CRMP-1依赖的基质抑制肺癌的转移和侵袭，CTGF是通过调节整合素偶联小G蛋白，从而影响CRMP-1的表达[13]。整合素是CCN蛋白家族的重要受体，并且受体激活作用可以产生多种。CTGF蛋白可以直接和整合素αvβ3和αⅡbβ3作用。CTGF和整合素αvβ3的相互作用能促进上皮细胞发生黏附和转移，并诱导新生血管的生成。CTGF也可以通过整合α6β1促进人皮肤成纤维细胞转移和增殖[14]。相反的，整合素αvβ3和αvβ5可能只针对CTGF介导的侵袭抑制。

综上所述，CTGF在肺癌组织中呈低表达，而在正常组织中高表达，其可能与肺癌的分期和转移有关。由于NSCLC的发生、发展很可能受多种机制的控制，且CTGF可能通过不同的机制参与了肿瘤的发生和发展。因此CTGF在肺癌中的真正机制仍需进一步研究。

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