二甲基亚砜和5-氮胞苷诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率

金 鹏 申星花 李学奇 (哈尔滨医科大学附属第四医院心内科，黑龙江 哈尔滨 150001)

细胞移植疗法治疗冠心病虽然取得了一定的疗效，但是还存在着许多限制和难题，最主要的问题就是移植细胞种类的确定和转化效率的高低。P19细胞是从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分离得到的一种能在体外培养的多能干细胞。一系列研究表明，P19 细胞在二甲基亚砜(DMSO)〔1〕或 5-氮胞苷(5-Aza)〔2〕的诱导下可以转化为心肌样细胞。本实验选取上述两种诱导剂分别诱导P19细胞，观察其诱导效率。

1 材料与方法

1.1 材料 P19细胞系购自上海拜力生物科技有限公司;DMSO，5-Aza(Sigma公司);α-MEM(Hyclone公司);胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青生物公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)，UV-530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)，PCR仪(美国Hybad公司)。

1.2 方法

1.2.1 P19细胞的培养 将P19细胞冻存管从液氮中取出，放入37℃温水中浸泡2 min，待其溶化后移入离心管，以1 000 r/min速度离心5 min，吸除上清液，向管内加入10 ml α-MEM培养液(含青霉素1万U/L、100 ml/L胎牛血清、链霉素100 mg/L，配置成pH7.2～7.4)重悬细胞，重复离心操作，吸除上清液。加入4 ml培养液重悬。置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。正常培养的P19细胞2～3 d传代1次，以0.25%胰蛋白酶消化传代，扩增培养。

1.2.2 P19细胞的诱导分化 取复苏后传5代的贴壁细胞，用磷酸盐缓冲液冲洗，以1∶1的比例取0.2 g/L EDTA和2.5 g/L的胰酶进行消化后，将密度为1×106个/L细胞接种在底部铺有一薄层5 g/L琼脂的10 cm2的细菌培养皿中，DMSO组以终浓度1.0%进行分化培养。5-Aza组以终浓度10 μmol/L进行分化培养。每2天更换一次普通培养液，并使用倒置显微镜对细胞的生长及形态变化进行观察。

1.2.3 RT-PCR分析GATA-4基因相对表达量 用Trizol法提取总RNA，测定A260/A280比值为1.8以上可用。小鼠心肌细胞标记物GATA-4上游引物5'-CCCTACCCAGCCTACATGG-3'，下游引物5'-ACATATCGAGATTGGGGTTGT-3'，产物271 bp。内参照物β-actin，上游引物5'-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游引物5'-TTGATGTCACGCACGATTT-3'，产物450 bp。循环参数为：预变性95℃ 5 min，变性94℃ 2 min，退火62℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，循环32次。最后72℃延伸5 min。电泳分析扩增结果，凝胶图像分析系统采集图像并照相记录。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察 三组研究对象在复苏后未分化的细胞均呈均匀、分散状态，3～4 h细胞贴壁，24 h半铺瓶底，48 h后细胞满布瓶底。DMSO和5-Aza组诱导4 d后，细胞均以克隆集落方式增殖，细胞形态呈现多样化，梭形细胞明显增多。8 d出现自发性节律收缩的心肌样细胞。诱导后2 w，5-Aza组分化细胞明显多于DMSO组。见图1。

2.2 诱导后心肌早期基因GATA-4的表达情况 除阴性对照组外，其他两组均表达心肌早期分化基因。见图2。每组15 d后表达量与本组7 d表达量相比较均明显增加。此外，5-Aza组诱导28 d基因表达量明显高于DMSO组28 d。见表1。

图1 倒置显微镜观察细胞形态(×100)

表1 各组GATA-4 mRNA相对表达量比较(s)

表1 各组GATA-4 mRNA相对表达量比较(s)

与本组7 d比较：1)P＜0.05;与DMSD组28 d比较：2)P＜0.05

7 d 15 d 28 d阴性对照组组别0 0 0 DMSO组 0.24±0.02 0.65±0.011) 0.99±0.021)5-Aza组 0.30±0.03 0.81±0.031) 1.25±0.011)2)

图2 各组GATA-4表达情况

3 讨论

干细胞的诱导分化是近年来生物医学研究领域的热点之一。P19细胞具有细胞分裂快，可在体外大量扩增，多向分化的潜能。本研究对不同诱导剂诱导P19细胞分化为心肌细胞的效率进行了分析。

目前发现有效的诱导剂主要为DMSO和5-Aza。DMSO具有抗氧化和抗炎作用，是发现较早的诱导剂之一，其作用机制主要是抑制c-myc基因表达，通过细胞内的钙离子短暂增加，激活对心肌分化有利的信号通路实现〔3〕。有研究证实1.0%DMSO可以更有效地诱导P19细胞分化为心肌细胞〔4〕。5-Aza主要在骨髓间充质干细胞向心肌分化的研究中广泛应用。在诱导单层P19细胞分化为心肌细胞中，5-Aza可能通过激活骨形态形成蛋白(BMP)信号途径调节心肌特异转录因子的活化而引起心肌细胞的发生〔5〕。本研究选取DMSO和5-Aza的常用有效浓度进行比较分析发现，二者均可诱导成心肌细胞，但28 d时显微镜下观察，5-Aza分化组的细胞数量多于DMSO组。两组在培养7 d时就可以观察到心肌特异性蛋白GATA-4的表达，而此时尚未出现细胞跳动，说明在心肌分化过程中，心肌特异蛋白的表达要早于心肌跳动的出现。GATA-4具有调节心肌发生、分化的作用，与心脏发育密切相关。本研究通过RT-PCR法检测两组GATA-4 mRNA的相对表达量，结果表明二者均转化成功，并且随着时间推移、转化的数量增多。但是28 d时5-Aza分化组的表达量多于 DMSO组，说明5-Aza的转化效率更强。

在干细胞治疗领域，大量定向分化的细胞对疾病的治疗至关重要。如何获得更多的分化细胞是研究的重点之一。本研究为进一步开发出高效的诱导方式提供了参考。

1 李秀华，张 雷，王海萍，等.P19细胞体外DMSO诱导向心肌样细胞分化〔J〕. 第四军医大学学报，2006;27(2)：129-32.

2 尹 青，赵 昱，陈 炜，等.应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞〔J〕. 解剖学报，2007;38(3)：325-9.

3 van der Heyden MA，Defize LH.Twenty one years of P19 cells：what an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation〔J〕.Cardiovasc Res，2003;58(2)：292-302.

4 尹 青，陈 炜，赵 昱，等.二甲基亚砜对P19细胞体外分化为心肌细胞的影响〔J〕.细胞生物学杂志，2007;4(29)：579-84.

5 Choi SC，Yoon J，Shim WJ，et al.5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells〔J〕.Exp Mol Med，2004;36(6)：515-23.