体外转染Klotho基因对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的影响

李宝善 马厚勋 王艳娇 吴 平 (重庆医科大学附属第一医院老年病科，重庆 400016)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是指缺血的心肌在成功恢复心脏血供的同时，血液循环中白细胞附壁、聚积，渗出血管而浸润心肌，导致心肌细胞坏死，加之补体激活以及活性氧的产生，致使心肌损伤更为严重，出现心肌舒缩功能降低、再灌注心律失常、梗死面积扩大等现象。随着经皮冠状动脉腔内成形术、冠脉内支架置入术等新疗法的广泛应用，MIRI越来越常见，并在缺血性心脏病病程中扮演了重要的角色，被认为是心肌保护问题的关键〔1〕。为此我们利用基因转染技术将Klotho基因转染至H9c2(2-1)大鼠心肌细胞，探讨转染Klotho基因对大鼠心肌细胞MIRI的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 质粒载体pAAV-MCS为Stratagene公司产品。RNAiso Plus、各种限制性内切酶、PrimeScriptⓇRT reagent Kit、Premix TaqⓇVersion2.0(Loading dye mix)、DNA Marker、T4 DNA连接酶为TakaRa公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。DMEM高糖培养基为美国Gibco公司产品。Fermentas转染试剂为美国MBI公司产品。H9c2(2-1)大鼠心肌细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。胎牛血清购自Hyclone公司。兔抗人、鼠Klotho抗体购自Abcam公司，FITC标记山羊抗兔IgG为博奥森公司产品。LDH与MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。昆明小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。免疫染色固定液、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、抗淬灭封片液均为碧云天公司产品。

1.1.2 主要仪器 Nano Drop2000微量分光光度计(Thermo)，s1000 PCR仪、DNA电泳凝胶成像系统(Bio-Rad)，Leica DM6000B荧光显微镜，HEPA Class100 3131型三气恒温细胞培养箱(Thermo)，SpectraMax M2e酶标仪(Molecular Devices)。

1.2 重组pAAV/Klotho质粒构建 参考赵景宏等〔2〕研究方法改进。

1.4 重组pAAV/Klotho质粒的构建 将PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定片段大小，胶回收3 kb左右条带。EcoR I/Xho I分别对腺相关病毒空载体pAAV-MCS进行双酶切，胶回收目的片段，然后将酶切后载体与之前酶切回收cDNA片段按1∶10(摩尔数比)进行连接，连接产物转化TOP10感受态细胞，转化后细胞涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。

1.5 重组pAAV/Klotho质粒的筛选与鉴定 经含氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落于37℃振荡培养过夜后提取质粒，通过EcoR I/Xho I酶切对阳性重组质粒pAAV/Klotho进行鉴定。最终将鉴定阳性重组质粒送上海生工生物工程公司进行DNA测序，测序结果与GenBank中所报道目的基因序列进行比对和分析。

1.6 H9c2(2-1)细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基，25 cm2罗口培养瓶，5%CO2孵箱培养。

1.7 H9c2(2-1)细胞缺血再灌注模型复制 用以高纯N2饱和、缺氧(1%O2)、无糖、缺钙的 D-hank液模拟缺血溶液，待H9c2(2-1)细胞生长至铺满80%时置换正常培养液，放人缺氧培养箱中4 h模拟缺血，再以含20%血清的正常培养液置换缺血溶液，开放培养于正常培养箱中12 h模拟再灌注〔3〕。

1.8 基因转染 参照Fermentas转染试剂说明进行。

1.9 实验分组 A.对照组(Control)：不转基因，常氧培养64 h;B.模拟I/R组(I/R组)：不转基因，常氧培养48 h后模拟I/R;C.转染Klotho基因组(Klotho组)：以Fermentas转染试剂为载体转染Klotho基因，常氧培养48 h后模拟I/R;D.转染空载体组(Vehicle control组)：不转基因，空载体，常氧培养48 h后模拟I/R;每组重复5次。

1.10 心肌细胞Klotho mRNA水平检测 各实验组细胞按RNAiso Plus说明书提取总RNA，溶于 DEPC处理水。Nano Drop2000微量分光光度计测浓度在 0.5 μg/μl以上，A260/A280在1.9左右。按 PrimeScriptⓇRT reagent Kit说明，10 μl体系加1 μg总RNA逆转录。以逆转录所得cDNA为模板，用Premix TaqⓇVersion2.0(Loading dye mix)PCR扩增，所用上、下游PCR引物序列分别为5'GGGTCACTGGGTCAATCT3'和5'GCAAAGTAGCCACAAAGG3'(NCBI Reference Sequence：NM_013823.2)，PCR产物长度为710 bp。内参同前。

1.11 Klotho蛋白表达检测(免疫荧光法)待各实验组培养细胞爬片，融合60%左右时固定20 min、PBS洗4遍，封闭60 min，结合一抗(1∶37.5)4℃过夜。PBS洗 4遍，1∶75二抗37℃孵育1 h，抗淬灭封片液封片，Leica正置荧光显微镜观察并采图。

1.12 ELISA检测各实验组细胞培养的上清液Klotho蛋白水平 按ELISA试剂盒说明书操作。

1.13 细胞损伤指标的检测 ①MTT比色法检测细胞活性：细胞培养液中加入MTT溶液，37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，加DMSO，轻摇10 min，测各孔吸光度值(OD值)。以对照组OD值均数为对比计算细胞活性：细胞活性=各孔OD值/对照组OD值均数。②LDH活性检测：按试剂盒说明进行操作，酶标仪检测吸光度值。③丙二醛(MDA)含量：操作方法参照试剂盒说明书，721紫外分光光度仪检测吸光度值。

2 结果

2.1 pAAV/Klotho质粒构建 以昆明小鼠肾脏总RNA为模板，通过RT-PCR技术克隆Klotho cDNA全长，EcoR I/Xho I双酶切，连接载体pAAV-MCS。经含氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落于37℃振荡培养过夜后提取质粒，通过EcoR I/Xho I酶切对阳性重组质粒pAAV/Klotho进行鉴定。阳性重组质粒EcoR I/Xho I双酶切后可见约4.7 kb载体片段和约3 kb Klotho cDNA片段(见图1)。将酶切鉴定阳性重组质粒送上海生工生物工程公司进行DNA测序，测序结果与GenBank中所报道目的基因序列完全一致。

2.2 RT-PCR检测各组Klotho mRNA表达情况 结果发现各实验组均有Klotho mRNA表达，但Klotho转染组Klotho mRNA表达水平明显高于其他组，其余各组间无显著性差异。说明Fermentas转染试剂为载体转染小鼠Klotho cDNA成功，有效使心肌细胞Klotho mRNA表达显著上调(如图2)。

图1 pAAV/Klotho载体酶切鉴定

2.3 免疫荧光法检测各组Klotho蛋白表达情况 免疫荧光法检测结果显示各组细胞膜及胞浆中 Klotho蛋白表达，其中Klotho转染组荧光表达较其他细胞组多，荧光强度更强，说明转染成功，结果满意。

2.4 各组细胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量检测结果 I/R后，细胞活性较正常对照组低，反映细胞损伤的指标LDH、MDA明显较正常对照组高(P＜0.01)。在I/R的三组中，Klotho转染组(C组)其细胞活性高于I/R对照组(B组)和空载体转染组(D组);而其反映细胞损伤的指标LDH、MDA明显低于I/R对照组(B组)和空载体转染组(D组)(P＜0.01)。细胞培养上清液中检测到的Klotho蛋白主要为分泌型Klotho蛋白，Klotho转染组的细胞培养上清液中分泌型Klotho蛋白含量明显高于其他三组(P＜0.01)。见表1。

图2 RT-PCR结果

图3 Klotho蛋白免疫荧光图

表1 各组细胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量检测结果( s，n=5)

表1 各组细胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量检测结果( s，n=5)

与A组相比：1)P＜0.01;与B组相比：2)P＜0.01;与D组相比：3)P＜0.01

组别 细胞活性(%)上清液LDH含量(U/L)上清液MDA含量(nmol/L)上清液Klotho蛋白含量(U/L)A 100±0 83.75±1.70 1.59±0.07 49.70±4.44 B 68.14±7.401) 218.45±2.791) 2.95±0.151) 45.63±0.811)C 81.32±9.931)2)3)122.15±6.461)2)3)0.53±0.081)2)3)76.85±10.881)2)3)D 69.54±9.211) 206.84±21.761) 2.66±0.351) 45.23±1.651)

3 讨论

Klotho基因是1997年由Kuro等〔4〕首先从衰老表现的模型小鼠中克隆成功，并以古希腊神话纺织生命之线女神的名字-Klotho来命名。研究发现该基因表达缺陷的小鼠会出现类似人衰老的一系列表型变化，动脉硬化和异位钙化、糖和能量代谢异常生殖器官萎缩、骨质疏松、肺气肿等。Klotho基因全长50 kb，包含5个外显子，4个内含子，在人类Klotgo基因定位于第13号染色体(13q12)，其可通过选择性拼接产生两种蛋白产物(Klotho)：一种为膜型Klotho蛋白，属于一种单次跨膜蛋白，其全长为1 012个氨基酸，主要在肾脏的远曲小管细胞及脑脉络丛等表达，其作为成纤维细胞生长因子23(fibroblasts growth factor 23，FGF23)专一性复合受体的主要成分而发挥其重要生理调节作用;另一种为分泌型Klotho蛋白，该类型缺乏跨膜结构和胞内结构区，全长为549个氨基酸，在小鼠血液、尿液及脑脊液中均能被检测到。

跨模型Klotho蛋白通过与Na+-K+ATP酶α1亚基结合，增加该亚基在细胞表面数量来实现其对细胞外钙浓度降低的应答反应〔5〕，具有调节离子通道活性;分泌型Klotho作为一种循环因子或激素，抑制细胞内胰岛素/胰岛素样生长因子-1(insulin/IGF-1)信号级联放大效应〔6〕，可抑制胰岛素/IGF-1信号通路;还可以抑制氧化应激以及Wnt信号转导〔7，8〕，并具有调节一氧化氮合成的作用。

本研究结果证明Klotho蛋白对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注具有很好的保护作用。本实验证实了Klotho的抗氧化应激作用，由此推测Klotho对H9C2(2-1)大鼠心肌细胞缺血再灌注的保护作用机制可能与抗氧化应激有关，是否还与Klotho调节心肌细胞膜离子通道活性、抑制胰岛素/IGF-1信号通路、抑制Wnt信号转导以及一氧化氮合成等作用有关，还有待证实。

目前基因治疗所用的基因载体主要有病毒和非病毒两类。非病毒载体脂质体具有下列优点：①易于制备，使用方便，可携带大的DNA片断;②毒性、免疫原性低;③可防止携带DNA被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中;④离体细胞可以瞬间表达外源基因〔9～11〕。本实验中使用的脂质体是新一代产品——Fermentas转染试剂，用其转染不受血清的干扰，转染操作更为方便。实验结果表明该Fermentas转染试剂介导的外源基因得到了有效表达。

总之，通过Fermentas转染试剂可以稳定地把Klotho基因转入H9c2(2-1)细胞，转染Klotho基因则可减轻H9c2(2-1)细胞模拟I-R损伤，对H9c2(2-1)细胞具有保护作用;同时本研究为探讨Klotho基因对缺血性心脏病的治疗作用、提高其安全性提供了可行的实验依据。

1 刘永国，任 澎.心肌缺血/再灌注损伤的机制研究进展〔J〕.医学综述，2010;21(16)：3267-9.

2 赵景宏，王军平，陈 默.编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(19)：2452-5.

3 张 琳，李东野，夏 勇，等.脂质体转染AKT基因对心肌细胞缺血-再灌注的影响〔J〕. 中国微循环，2009;13(4)：236-8.

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5 Imura A，Tsuji Y，Murata M，et al.Alpha-Klotho as a regulator of calcium homeostasis〔J〕.Science，2007;316：1615-8.

6 Torres PU，Prié D，Molina-Blétry V，et al.Klotho：an antiaging protein involved in mineral and vitamin D metabolism〔J〕.Kidney Int，2007;71(8)：730-7.

7 Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，et al.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999;104：229-37.

8 Liu H，Fergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging〔J〕.Science，2007;317：803-6.

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