地骨皮总黄酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究

陈志春，王英豪

（1.福州屏山制药厂，福建 福州 350003；2.福建中医药大学，福建 福州 350122）

地骨皮总黄酮的提取及酪氨酸酶活性抑制研究

陈志春1，王英豪2

（1.福州屏山制药厂，福建 福州 350003；2.福建中医药大学，福建 福州 350122）

目的 优选地骨皮总黄酮的提取工艺及其对酪氨酸酶活性的抑制。 方法 采用L9（34）正交表设计实验，以地骨皮总黄酮为考察指标，采用紫外分光光度法测定其含量，优选提取工艺；采用多巴速率氧化法，测定其对酪氨酸酶活性的影响。 结果 乙醇浓度对提取效果具有显著性影响（P＜0.05），经优化后的最佳提取工艺条件为：4倍量50%乙醇，提取3次，每次1 h。 结论 优选工艺得到的地骨皮总黄酮含量高，且总黄酮具有较强的酪氨酸酶活性抑制作用。

地骨皮；总黄酮；紫外分光光度法；酪氨酸酶

地骨皮为茄科植物枸杞Lycium chinense Mil1．或宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥根皮，其名始见于《外台秘要》，是以根的形状象细的骨头而命名的。地骨皮性寒、味甘，归肺、肝、肾经，具有凉血除蒸、清肺降火之功效，用于阴虚发热、盗汗骨蒸、肺热咳嗽、血热出血、内热消渴等证［1-2］。现代药理研究表明地骨皮主要具有降血压、降血糖、调血脂、解热、抗菌及抗病毒等活性［2-3］，药用价值非常明显。前期试验我们证实了地骨皮能抑制酪氨酸酶活性，具有祛斑美白作用［4］。为了便于对地骨皮深入研究，本文对其黄酮类物质的提取方法及提取液的酪氨酸酶活性抑制作用进行了研究，为其进一步开发利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

紫外-可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司）；电子分析天平（FA20004N，上海精密科学仪器有限公司）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707）；地骨皮药材购于福建中医药大学国医堂；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 地骨皮总黄酮的提取工艺

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg／mL的芦丁对照品液。

2.1.2 标准曲线的建立［4］分别精密吸取芦丁对照品液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，均加入70%乙醇至10 mL；再加入5%的亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min；再加入10%的硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%的氢氧化钠溶液5.5 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以70%乙醇作参比溶液，于波长510 nm处测定吸光度。以吸光度值（A）为纵坐标，芦丁对照品含量为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程：Y＝0.498X－0.0073（R＝0.9999），结果表明芦丁在 0.1～1.6 mg范围内呈良好线性关系，见图1、表1。

表1 芦丁标准曲线考察结果

2.1.3 样品的制备 取地骨皮等量9份，按L9（34）正交试验条件回流提取，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩，定容于25 ml容量瓶中。L9（34）正交试验表头设计见表2、表3。

表2 因素水平表

2.1.4 样品总黄酮含量测定 精密吸取样品液0.25 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.2中的方法显色，测定吸光度值，计算总黄酮含量。结果见表3。

表3 正交试验结果表

2.1.5 正交结果分析 对正交试验所得结果作直观分析和分差分析，以判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出在该试验条件下最优的提取条件。直观分析结果见图2，方差分析结果见表4。

表4 方差分析表

由直观分析可知，各因素水平优劣分别为A1＞A2＝A3；B1＞B3＞B2；C3＞C2＞C1；D3＞D2＞D1，即乙醇浓度50%优于75%和90%；乙醇用量4倍优于6倍优于5倍；提取时间1.5 h优于1 h和0.5 h；提取次数3次优于2次优于1次。极差R值大小显示，各因素作用主次为A＞D＞C＞B。方差分析结果表明：A因素、D因素的影响具有显著性意义（P＜0.05），最后确定最佳提取工艺为A1B1C2D3。

2.2 地骨皮总黄酮对酪氨酸酶活性的影响

2.2.1 酪氨酸酶活性的测定 采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测［5］，反应混合物与体积见表5。

测定时，用移液管按表5所示体积，分别吸取a、b、c、d 4组反应液的前3种于容量瓶中，温育后加入L-多巴反应2 min时测定吸光度（A475）值。以磷酸盐缓冲液（PBS）为空白，以不加药物的反应组为对照，分别测定4份已知总黄酮含量的样品液对酪氨酸酶（Tyr）活性的抑制率。实验重复3次，取平均值，按下式计算酪氨酸酶的抑制率，结果见图3。

酪氨酸酶抑制率 ／%＝［（A475a－A475b）－（A475c－A475d）］／（A475a－A475b）×100%

式中：a为未加中药的加酶混合液；b为未加中药和酶的混合液；c为加中药和酶的混合液；d为加中药而未加酶的混合液。

表5 反应混合物与体积mL

2.2.2 地骨皮总黄酮对酪氨酸酶活性的影响 取已知总黄酮含量的样品液4份，按2.2.1测定其对酪氨酸酶的抑制作用，结果见图3。结果显示随着地骨皮总黄酮含量的增高，其对酪氨酸酶的抑制也增高，存在一定的量效关系。

2.3 验证试验 为确证该工艺的优劣和稳定性，按筛选的最佳条件，平行制备3份地骨皮样品液，精密吸取样品液0.25 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.2中的方法显色，测定吸光度值，计算总黄酮含量，并测定总黄酮对酪氨酸酶的抑制率。验证结果见表6。

表6 验证试验结果

验证试验结果说明：所筛选的提取工艺条件基本稳定。

3 讨 论

3.1 最佳工艺的确定 本文采用L9（34）正交设计优选地骨皮总黄酮含量的最佳提取条件，结果由R值可知地骨皮的提取条件以A1B12C3D3组合为最佳，但鉴于成本与时间，并且提取时间对总黄酮含量影响甚小，无显著性差异，故改为提取时间1 h，即最后确定最佳提取工艺为50%乙醇4倍量提取3次，每次1 h。由于乙醇浓度、提取次数对工艺有显著影响，今后做进一步放大实验或工业生产中，应特别注意乙醇浓度。

3.2 测定方法的选择 地骨皮所含的黄酮类化合物能与金属铝离子螯合成络合物而显红色，在510 nm处形成新的吸收峰，故本文以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法，测定了地骨皮药材中总黄酮含量。结果三批样品中总黄酮的含量较为接近，且具有较强的酪氨酸酶活性抑制作用。

3.3 应用前景 前期试验我们证实了地骨皮能抑制酪氨酸酶活性，具有祛斑美白作用［4］，其机制可能为黄酮化合物作为酪氨酸酶的底物替代剂，取代酶的作用，达到抑制黑素的目的。本研究采用正交设计对地骨皮总黄酮提取工艺进行优化，并对最佳工艺进行了验证实验。结果证明：随着总黄酮含量的增高，酪氨酸酶活性抑制率亦增强，为进一步开发利用地骨皮提供了理论依据。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2010：115.

［2］刘洪超，郭庆梅，周凤琴.地骨皮的功效考证与现代药理学研究比较［J］.山东中医药大学学报，2009，33（6）：533-534.

［3］国家中医药管理局《中华本草》编辑委员会.中华本草［M］.7册.北京：科学与技术出版社，1999：274.

［4］王英豪，魏国强，张理平.马齿苋总黄酮含量测定方法的建立［J］.福建中医药大学学报，2012，22（2）：44-45.

［5］张理平，张海燕，王英豪，等.28味中药酸性成分提取物影响黑素合成的实验研究［J］. 中华中医药杂志，2009，24（11）：1443-1445.

R284.2

A

1000-338X（2012）04-0054-03

2012-5-20

福建省教育厅科技资助项目（JA10172）

陈志春（1969—），男，主管药师，主要从事中药管理与研究工作。

王英豪，男，讲师。 E-mail：39887219@qq.com