Survivin特性及其在抗肿瘤中的应用

蔡贤福，何卫阳(综述)，肖明朝(审校)

(重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆 400016)

Survivin是凋亡抑制基因家族中的一员，在细胞生长发育中起重要作用。Survivin在肿瘤组织中高表达，在分化成熟的正常组织中不表达，此外，Survivin还参与细胞周期的调控，这些特性表明Survivin与肿瘤的发生、发展密切相关。自1997年Ambrosini等［1］首次发现抑制细胞凋亡基因Survivin在肿瘤和淋巴瘤中表达以来，围绕Survivin应用于肿瘤诊断、肿瘤治疗的研究越来越多。现就近年来Survivin在抗肿瘤应用的研究进展综述如下。

1 Survivin的生物学特性

1.1 Survivin的结构及分布 凋亡抑制基因家族(inhibitor of apoptosis，IAPs)包括 X-IAP、c-IAP1、c-IAP2、ILP-2、MLIAP、NAIP、Apollon/BRUCE 和 Survivin 共 8种。在IAPs家族中，Survivin的相对分子质量最小且结构与其他成员不同。IAP家族成员共同的结构特点是具有2～3个杆状病毒组成的IAP重复结构(baculovirus IAP repeat，BIR)，每个BIR结构域含60～70个氨基酸残基，由3个反向平行的β折叠和4个α螺旋组成，一些IAPs还有一个环指结构(RING);而Survivin只含有一个BIR结构域，C端缺乏环指结构，但形成了一个富含疏水基团 α螺旋［2］。编码Survivin的基因位于17q25，转录后经mRNA编辑获得至少5种剪接变体，它们分别是 Survivin、Survivin2B、SurvivinΔEx3、Survivin3B 和 Survivin2α［3］。有研究表明，未分化的正常成人组织中，如造血干细胞、T细胞、角质细胞、神经干细胞可表达 Survivin［1］;在分化成熟的正常组织中，胎盘、胸腺组织和结肠基底部的上皮细胞中有少量的表达，其余分化成熟的正常组织几乎不能检测出Survivin的表达量，而这些表达Survivin的正常的增生组织或细胞通常表达量也很低，通常 ＜ 5%［4］。当细胞发生转化或恶变时Survivin表达显著增加，在肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌以及体内接近50%的高评分非霍奇金淋巴瘤等肿瘤组织中高表达［5］。

1.2 Survivn的作用机制 目前关于Survivin抑制细胞凋亡的机制尚未完全阐明。IAPs是通过作用于抑制凋亡的终末效应器半胱天冬氨酸酶(caspase-3、caspase-7、caspase-9)而作用于细胞周期的信号转导通路来抑制细胞凋亡。目前IAPs抑制caspase至少有2种路径:一种是细胞色素C的线粒体路径，另一种是肿瘤坏死因子家族的死亡受体路径。IAPs也对第3种较少见的路径(颗粒酶B直接激活caspase-3)有影响［1］。Khan 等［6］研究表明，Survivin 的作用机制可能与扰乱了正常的细胞周期有关，并依赖于抑制凋亡的终末效应器caspase-2和caspase-9)发挥作用，以及与线粒体除极诱导凋亡相关。在肿瘤微环境中细胞外的Survivin参与细胞的保护作用，并能增强肿瘤细胞转移能力。也有研究发现Survivin的过度表达通过抑制caspase-3间接作用于细胞周期激酶p34cdc2，从而调节细胞周期的进展及凋亡［5］。Li等［7］研究表明，Survivin表达于细胞周期的G2/M期并参与细胞周期的调节，破坏Survivin的微管作用可诱导细胞周期的G2/M期caspase-3激活。Virrey等［8］证实，采用SiRNA干扰技术下调Survivin的表达后，可上调caspase-4及caspase-7的表达，促使肿瘤细胞凋亡。因此，虽然目前对Survivin抑制细胞凋亡的具体机制尚存在争议，但是对Survivin抑制细胞凋亡的作用是肯定的。

2 Survivin在抗肿瘤方面的相关研究

2.1 药物通过Survivin的抗肿瘤效应 Survivin的这种生物学特性使之成为肿瘤靶向治疗的研究热点。Survivin为药物研究提供了新的靶点，血根碱(sanguinarine)是一种从罂粟科植物中提取的白屈菜生物碱的衍生物。最近被证实是一种新型的Survivin抑制剂，并且高选择地杀灭前列腺癌细胞。而Survivn在激素非依赖性前列腺癌的进展及对化疗药物的抵抗中发挥着重要作用。血根碱能通过泛素蛋白酶通路增强前列腺癌DU145细胞中Survivn蛋白的降解，从而诱导体内前列腺癌细胞凋亡及抑制肿瘤生长。异位植入的前列腺癌细胞给予血根碱后，可使体内的前列腺肿瘤重量及体积明显减小。血根碱可能会增加紫杉醇抗肿瘤的敏感性，增强紫杉醇介导的肿瘤抑制与细胞凋亡［9］。一些从传统的中药中提取的成分，如南蛇藤纯、三萜烯具有抗肿瘤效应，现已进入临床试验，研究发现其作用机制可能与增强凋亡内源性(线粒体途径)的活性有关，进而促使 caspase-3、caspase-7和caspase-9活化，同时抑制Survivin等IAPs家族的基因表达，甚至还能上调死亡受体表达水平，可通过对信号通路多个环节的干预发挥抗肿瘤效应［10］。葡萄糖胺对恶性细胞和转移瘤具有毒性，而对正常组织具有低毒性。Chesnokov等［11］证实其作用机制是通过细胞周期停留在G1期抑制DNA的合成，并抑制信号转导与转录激活子3及Survivin基因的表达，促进凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。癌症的最佳治疗方式就是建立一个有效的平衡，杀灭肿瘤细胞的同时能尽可能降低药物对机体的影响，并能有效抑制肿瘤细胞生长。这就需要一个抑制癌细胞生长依赖的分子靶点，而Survivin就具有这样良好的靶点。新近发现的一个新的强有力的Survivin抑制剂SPC3042比其他反义药物靶向抗癌药抑制Survivn mRNA更强效、更稳定，通过下调Survivin和原癌基因Bcl-2从而使细胞周期停止，显著地促进细胞凋亡。体内和体外试验均证实SPC3042可以使紫杉醇治疗前列腺癌的敏感性增加［12］。

2.2 Surviivin的基因治疗 由于基因组技术和蛋白组技术的进一步发展，RNA干扰技术发展迅速，现已广泛应用于实验领域，它是将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，促使特定mRNA片段降解，导致相应蛋白质无法合成，从而达到基因沉默，关闭特定基因的目的。Yin等［13］用腺病毒介导的siRNA抑制Survivin的表达，并建立肝癌的裸鼠动物模型，并向动物模型内注入构建好的siRNA，观察肿瘤的生长，并建立肿瘤生长曲线，实验证实AdsiRNA-Survivin在动物体内实验中可以通过诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长，并且抑制效果与注射的剂量之间具有良好的相关性。有研究表明Survivin与δ-catenin(δ-连环素)联系紧密。δ-catenin属于 p120-catenin蛋白家族，主要在脑组织中特异性表达，可是最近发现 δ-catenin在前列腺癌中高表达。Zeng等［14］建立裸鼠动物模型采用基因转染和siRNA证明了δ-catenin的表达可使Survivin和Bcl-2的表达增加，并且减少细胞周期抑制因子(p21Cip1)而使cyclinD1和cdc34上调，使组蛋白H-3磷酸化增加，促进细胞进入有丝分裂。δ-catenin在前列腺癌中有促进癌细胞增殖的作用。用siRNA减低δ-catenin的表达可有效抑制前列腺癌细胞的生长。而δ-catenin的表达促进Survivin和Bcl-2表达的机制以及δ-catenin在前列腺癌中的过度表达作用尚不完全清楚。也有采用siRNA技术剔除Survivin的表达可增强肿瘤对化疗药物敏感性的报道［15］。目前针对Survivin的靶点研究的主要方法还有采用反义寡核苷酸、酶活性RNA(ribozymes)、显性负突变体(dominant-negative mutants)及小分子抑制剂(small-molecule antagonists)等。而仅有反义寡核苷酸和小分子抑制剂进入临床前期研究［16］。尽管当前基因技术发展迅速，但仍有安全性等问题急需解决。目前大多仍停留在动物实验阶段。

2.3 Survivin在免疫治疗中的应用 肿瘤的免疫治疗只针对肿瘤细胞发挥免疫杀伤作用，而对正常组织细胞无损害。多种针对病毒感染的疫苗制备应用于临床，在疾病的预防及治疗显示出良好的效果。最近FDA批准将抗癌新药Provenge(sipuleucel-T)用于进展期前列腺癌的治疗，这是一种新型的树突状细胞(dendritic cells，DCs)疫苗，作用机制是通过高效的抗原递呈激发人体自身细胞免疫对抗肿瘤，具有高效的靶向性以及不良反应小等优点，可见免疫治疗应用前景极其广阔。当机体新发肿瘤后，机体中适应性免疫起主要作用。适应性免疫中主要由T细胞和B细胞执行免疫作用。而确定肿瘤的特异性抗原和肿瘤相关抗原对肿瘤的早期发现，诊断及治疗非常重要［17］。然而，在发挥免疫效应对抗肿瘤的同时还存在着肿瘤相关抗原或特异性抗原激发体液免疫产生的抗体封闭了抗原，从而干扰细胞免疫的特异性杀伤作用的矛盾。肿瘤细胞的杀伤作用以细胞免疫为主，因此细胞疫苗抗肿瘤成为目前肿瘤免疫治疗的一个方向。肿瘤疫苗的目标是诱导产生肿瘤特异的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTLs)，DCs是目前已知的体内最强的抗原递呈细胞，在起始和调节主要的免疫应答反应中有决定性作用。DCs表面的主要组织相容性复合体Ⅰ和主要组织相容性复合体Ⅱ衍生的肿瘤相关抗原在制备基于DCs的肿瘤疫苗中相当普遍［18］。Survivin的生物学特性具有良好的免疫原性，因此，关于Survivn在免疫治疗应用的研究相继出现。

目前多价疫苗提高了肺癌的免疫治疗的效率。Karanikas等［19］对23例非小细胞肺癌患者样本(12例腺癌，8例鳞状细胞癌，3例细支气管癌)用定时和半定量反转录-聚合酶链反应检测，具有优势的肿瘤相关抗原(Survivin-std/Survivin-2B)，有22例被检测出(95.5%)。Survivin-std/Survivin-2B/Survivin-2B/人端粒酶反转录酶有19例被检测出(82.5%)，Survivin-std与Survivin-2B的表达及人端粒酶反转录酶有明显的正相关关系。这些基因的表达与患者年龄及肿瘤大小具有相关性。研究表明，肺癌存在肿瘤相关抗原对肿瘤多效价疫苗研究提供了帮助。基于Survivin的疫苗能有效地抑制恶性肿瘤细胞，Xiang等［20］采用基因克隆构建SurvivinDNA疫苗以及建立大鼠肺癌模型，并对其作用进行检测和分析。实验证实SurvivinDNA疫苗能够抑制肺肿瘤细胞的生长和转移。Survivn的靶点能够诱导CTL介导细胞凋亡，并能抑制肿瘤新生血管生成。此项研究还发现该疫苗对小鼠的伤口愈合和生育能力没有影响，且可以增强 DCs表达细胞黏附分子 1、CD80、和DEC205。此项研究给治疗转移性肺癌以及非小细胞型肺癌提供了新的策略。随着技术的不断改进，此种方式的免疫治疗给恶性肿瘤的预防和治疗带来了广阔的前景。

目前研究表明，Survivin对膀胱癌的早期诊断具有高度的敏感性和特异性［21-22］。Kitamura 等［23］研究Survivin所表达的蛋白是否是肿瘤免疫治疗的良好靶点，即是否具有肿瘤特异的抗原，对88例经尿道和根治性膀胱切除的膀胱癌患者标本采用了免疫组化染色法对Survivin和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅰ进行检测。其中 Survivin和 HLAⅠ表达分别有77例(87.5%)和59例(67.0%)，两者都表达的有56(63.6%)。在膀胱癌患者中的抗Survivin抗体显著高于对照组。各种免疫治疗方法应用于泌尿系统肿瘤的治疗是可行的，包括蛋白疫苗、裸DNA疫苗、重组病毒疫苗、DCs疫苗等［24］。Survivin在肿瘤中高度的敏感性与特异性使之成为免疫治疗的良好的靶目标。

Pisarev等［25］分别在健康志愿者和前列腺癌患者中收集HLA-A2阳性的单核细胞培养并分离出DCs，并用腺病毒将全长和显负性的Survivin基因包装转染至DCs，经过3次刺激后，应用γ干扰素相关酶联免疫斑点技术(ELISPOT)和CTL分析检测三种Survivin来源与HLA-A2匹配的多肽片段刺激后T细胞应答反应情况。所有的健康志愿者和2/3的患者被证实对靶细胞有特定的CTL应答。由于Survivin在CD34+造血原始细胞(HPCs)中表达，因此对抗SurvivinCTLs是否会存在正常的组织，发现特定的Survivin所引起的CTLs的CD34+成熟形成造血原始细胞过程中并没有显著减低。该研究证实，DCs转染的显负性的Survivin诱导潜在的Survivin特定的CTL应答。这项研究首次研究了用全长的Survivin基因进行癌症的免疫治疗。Sørensen等［26］从 HLA-A2阳性的乳腺癌患者中抽取外周血，患者特征是导管肿瘤细胞播散至肺、肝、淋巴结及皮肤，雌孕激素受体阴性，分为化疗和非化疗两组。外周血样本用淋巴细胞分离剂进行分离，并采用流式细胞仪放射免疫测定。T细胞用HLA-A2/Sur1M2的荧光耦合CD8抗体染色，两种阳性细胞分类进行克隆，并对克隆结果特征和功能用放射性51Cr进行测定分析。结果显示，Sur1M2特定的T细胞克隆可以杀死各种不同的癌细胞系(黑素瘤、乳腺癌、结肠癌)，其资料显示作为一个肿瘤抗原，Survivin可能是一个广泛适用的肿瘤免疫治疗靶抗原。

3 展望

Survivin也在正常的造血原始细胞及内皮细胞表达，那么应用Survivin疫苗后可能会对正常造血原始细胞和内皮细胞有杀伤作用，因此可能限制其在临床的应用。现有的肿瘤疫苗抗肿瘤作用效果不能令人满意，这就提示在肿瘤免疫应答中多效价的肿瘤相关抗原(如肿瘤相关抗原)可能会发挥更好的抗肿瘤作用［27］。免疫治疗不仅可以作为其他治疗方式的一种辅助治疗，增强放化疗敏感性，也可能作为肿瘤治疗的一种选择。在这方面，肿瘤的靶蛋白对抗肿瘤疫苗来说至关重要［28］。肿瘤相关抗原免疫治疗应用于离体细胞抗肿瘤作用效果显著，将其回输体内后高表达的抗原是否会刺激体内体液免疫产生抗体而封闭了抗原，是以后研究中需要克服的问题。尽管目前免疫治疗尚有一些问题需要克服，对以Survivin为靶抗原的免疫治疗的研究，将有助于进一步探讨Survivin的作用机制，其具体作用机制的深入研究可能会成为肿瘤疫苗取得突破性进展的关键。

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