维生素D及其受体对3T3-L1前脂肪细胞分化影响的分子机制

张力翔(综述)，缪 珩(审校)

(南京医科大学第二附属医院内分泌科，南京 210011)

肥胖不仅影响患者的生活质量和体型的美观，更重要的是它往往会伴发其他更严重的疾病，比如2型糖尿病、冠心病、代谢综合征等。肥胖病理过程包括脂肪细胞体积的增大以及细胞数目的增多;数目增多可归因于前脂肪细胞增殖、分化过度［1］。因此，若能研究透彻前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程中的分子事件，无疑会给治疗肥胖开辟一条新的途径。Ishida 等［2］研究发现维生素 D3［1，25-(OH)2D3］抑制3T3-L1分化为成熟脂肪细胞。3T3-L1是早在1974年就已建立的前脂肪细胞系，它从发育17～19 d的鼠胚中分离出来可定向分化为成熟脂肪细胞，被广泛地用于研究前脂肪细胞分化、特异性基因表达及脂质代谢的研究［3］。几年前发现肥胖患者多伴有体内低维生素D水平［4-5］，而且实验发现饮食补充维生素D或血清维生素D较高的肥胖患者减肥效果较对照组更明显［6］。所以研究维生素D及其受体(vitamin D receptor，VDR)对前脂肪细胞分化的影响成了热点，现对此领域的研究进展予以综述。

1 3T3-L1的分化过程及分子事件

1.1 3T3-L1的分化过程3T3-L1在含有胎牛血清的培养基里也能自发地发生分化，但整个过程需持续好几周，如果加入含有地塞米松、胰岛素以及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤组成的促分化液，仅需1周时间就能让细胞分化成熟。现多把其分化过程分为以下几个阶段。

1.1.1 生长停止期 细胞生长融合胞间相互接触抑制并停止分裂，生长停止是细胞分化必需经历的，至于胞间接触抑制，有研究发现其并不是分化所必须［7］，随后研究发现了诱导该期的分子机制［8-9］。

1.1.2 克隆增殖期 一般在经历两天的生长停止期后加入促分化液，细胞又开始至少一轮的分裂增殖，这个过程是分化所必需的［10-11］。该期细胞的分裂增殖与分化诱导前普通的有丝分裂有所不同，主要表现在某些基因和蛋白的表达上［12］，其中的具体机制及意义目前研究较少。

1.1.3 终末分化期 细胞进入该期后获得了对胰岛素的敏感性，与脂质代谢相关的基因表达增加，酶活性提高;细胞开始合成具有脂肪组织特异性的分子，如脂肪酸结合蛋白2、脂肪酸转运蛋白(FAT)、围脂滴蛋白(perilipin)等;细胞形态也随着脂滴的增大从梭形纤维细胞状变成圆球形;至此，3T3-L1就完成了从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化。

1.2 分子事件 为了便于叙述，将细胞未加入促分化液前定为前脂肪细胞期，加入促分化液(day0)至day2为分化早期，day5至day6为分化晚期，day7往后为成熟脂肪细胞期。在整个分化过程中，各种基因和蛋白时序性的表达发挥着各种相应的调节作用，各自分工而又相互协调形成一个精密的网络。其中对细胞分化有重要调节作用且研究相对比较透彻的有以下两个因子。

1.2.1 C/EBP 家族 CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP)属于转录因子家族，分为α、β、δ三种异构体。C/EBPβ和C/EBPδ在前脂肪细胞中有基础表达，在分化开始即克隆增殖期表达升高，到分化晚期后C/EBPβ表达降为基础值的一半而C/EBPδ则几乎检测不到［13］。可以使C/EBPβ和C/EBPδ表达升高的因素都可以促进3T3-L1的分化［14］。C/EBPα在分化晚期开始表达，它可以转录激活许多脂肪细胞特异性基因，如脂肪酸结合蛋白2、葡萄糖转运蛋白4、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、瘦素、胰岛素受体等;C/EBPα在分化中发挥着很重要的作用［15］，无需促分化液，单是过表达C/EBPα就足以使3T3-L1分化，而反义C/EBPα mRNA就能阻止分化［16-17］。

1.2.2 PPARγ PPARγ 属于核受体家族，有 γ1、γ2、γ3三种异构体，其中γ2主要在脂肪组织中表达，对诱导和维持脂肪细胞的脂质代谢有重要的调节作用。无论在体内还是体外，PPARγ对脂质形成都是必需的［18］。目前已知PPARγ的配体有多不饱和脂肪酸、噻唑烷二酮类、wy-14、463、氯贝丁酯等［19-20］。配体激活后，PPARγ与视黄酸类X受体(retinoid X receptor，RXR)结合形成具有转录激活效应的异二聚体，与所调节基因启动子的PPAR反应元件结合激活大量与脂肪酸代谢相关的酶基因，如脂肪酸结合蛋白2、脂蛋白酶、乙酰辅酶A、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等。因此，PPARγ配体的浓度及活性间接地通过对PPARγ转录活性的调节而对细胞分化起作用。

C/EBPβ 和 δ 在分化早期表达升高［10］，随后诱导C/EBPα和PPARγ，后两者相互促进发挥协同作用诱导下游的各种调节基因，使细胞完成分化过程［21］。综合众多的研究可以认为，在复杂的分化调节网络中，C/EBPs和PPARγ处于相对上游和(或)主干位置，在脂肪细胞分化中扮演着重要角色，1，25-(OH)2D3、VDR是通过什么机制与它们作用进而抑制前脂肪细胞的分化将在下文叙述。

2 维生素D及其受体对3T3-L1前脂肪细胞分化影响的机制

1，25-(OH)2D3是维生素D在体内发挥生物学作用的活性形式，也是与VDR亲和力最高的配体，它属于脂溶性维生素，是固醇类衍生物;VDR属于核受体家族，未结合配体时，与共抑制子作用抑制所调节基因的表达，被配体激活后与RXR结合形成三聚体，调节多种基因［22］。在细胞开始分化48 h后再加入1，25-(OH)2D3已无抑制效应出现，并且干预时间长达3 d的细胞撤除1，25-(OH)2D3后仍能继续分化成熟［23］。这表明1，25-(OH)2D3抑制前脂肪细胞分化是可逆的，且其抑制的分子机制定位为分化早期，目前发生在分化早期的事件主要有以下四个。

2.1 克隆增殖 已证实1，25-(OH)2D3对细胞增殖有抑制效应［24］，但是 Kong等［23］用库特氏计数器证实1，25-(OH)2D3对该期细胞增殖的影响无统计学意义。

2.2 PPARγ配体 分化开始后PPARγ的内源性配体生成增多［25］。Blumberg 等［26］构建了 3T3-L1 5B2细胞系，该细胞系可以检测PPARγ内源性配体的活性，加入1，25-(OH)2D3后配体活性降低;但若同时加入PPARγ的合成配体——罗格列酮，则无抑制作用，说明1，25-(OH)2D3并不是抑制配体与 PPARγ的结合，故推测1，25-(OH)2D3减少了分化早期PPARγ配体的形成。

2.3 C/EBPβ 和 C/EBPδ 1，25-(OH)2D3对 C/EBPδ蛋白表达量无影响［26］。在对 C/EBPβ mRNA的表达方面，研究出现了分歧:Blumberg等［26］通过实时定量聚合酶链反应得出1，25-(OH)2D3减少C/EBPβ mRNA 的表达，Kong等［23］采用 Northern Blot得出1，25-(OH)2D3对 C/EBPβmRNA 的表达无影响，两者结论不同可能是因为实时定量聚合酶链反应敏感性更高。而1，25-(OH)2D3是否影响 C/EBPβ的转录活性，研究结果再次出现不同。Kong等［23］采用构建 C/EBPREx3-tk-Luc(即 C/EBPβ 反应结合元件-荧光素酶)质粒的方法得出 1，25-(OH)2D3对 C/EBPβ的转录活性无抑制作用，而Blumberg等［26］则发现 1，25-(OH)2D3增加了 ETO/MTG8表达量，ETO/MTG8是一种C/EBPβ的转录活性抑制剂，它可以与C/EBPβ结合直接阻止其与调节基因的结合，进而抑制了C/EBPβ的转录活性［27］。两者的结论不一致，可能是因为C/EBPβ属于转录因子，发挥其转录活性需要从细胞质转运入核后再与所调节基因启动子结合，整个过程会受到细胞质及细胞核中多种因素的影响，质粒转染后仅存在于细胞质，所以Kong等［23］采用的方法反映的是细胞质中C/EBPβ的生物活性，因此不能精确代表核内C/EBPβ的活性。而且，Blumberg等［26］在抽提核蛋白后采用Western blot发现C/EBPβ在细胞核内的蛋白量减少。综上所述，1，25-(OH)2D3抑制了C/EBPβ基因的表达，减少了其蛋白在核内的浓度，间接地降低了转录活性，进而影响下游的分子事件抑制分化。

2.4 VDR VDR在分化早期表达升高。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤是磷酸二酯酶抑制剂，可使细胞内环单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的浓度升高，已在其他类型细胞中证实通过cAMP通路可以增加 VDR 表达［28-29］，Blumberg等［26］也证实促分化液中只有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤可诱导VDR表达，因此推测，VDR的早期表达与cAMP通路有关。培养基和细胞质中的1，25-(OH)2D3水平极低，表达升高的VDR主要是以未结合配体(unliganded VDR，uVDR)的形式存在。为了阐明uVDR的作用，Blumberg等［26］用小干扰RNA的方法使VDR的表达明显减少，结果干扰VDR表达后1，25-(OH)2D3对分化的抑制作用消失，同时细胞分化成熟后胞质中脂滴明显减少，但PPARγ的表达未受影响［26］，再次证明了1，25-(OH)2D3对分化的抑制作用是由 VDR介导，而且阻断VDR后细胞储脂能力降低与PPARγ通路无关，具体机制不清。Kong等［23］的实验发现另一个结论:不加1，25-(OH)2D3，仅过表达人型VDR就可以抑制细胞分化。推测uVDR对细胞分化也具有抑制性，所以正常情况下，进入分化晚期后以及成熟脂肪细胞中都检测不到 VDR;因为1，25-(OH)2D3加入后与VDR结合可以延缓VDR降解［30］，致使到了分化晚期 VDR仍然存在，这可能也是 1，25-(OH)2D3抑制细胞分化的另一个原因。

除了以上所述机制之外，1，25-(OH)2D3对分化晚期的分子事件也有影响。Kong等［23］采用Northern blot方法发现 1，25-(OH)2D3抑制了 C/EBPα 和PPARγ的mRNA表达，同时采用构建质粒的方法证实1，25-(OH)2D3对C/EBPα的转录活性没有影响，却降低了PPARγ的转录活性。此机制证实为:加入1，25-(OH)2D3后，VDR与PPARγ共同竞争数量有限的RXR，导致 PPARγ转录活性降低［23］。总之，科研工作者经过这么多年的努力，对1，25-(OH)2D3和VDR对前脂肪细胞分化影响的分子机制有了一个主干上的整体把握，而更多更具体的细节分子事件还有待进一步探索。

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