细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展

杨泽栋(综述)，李永东(审校)

(内蒙古医学院第三附属医院心内科，内蒙古包头 014010)

急性心肌梗死是严重危害人类生命健康的常见病，急性心肌梗死后心肌细胞凋亡存在时间长，可引起左心室扩张、心率衰竭等严重不良事件［1］。国内外针对心肌梗死中细胞凋亡的研究日益深入。细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)是线粒体呼吸链的重要组成部分，研究显示Cyt C在细胞凋亡中起着重要的作用［2］。现就Cyt C评价心肌细胞凋亡的现状综述如下。

1 Cyt C结构和功能

Cyt C是一个高度离子化的分子，相对分子质量为(12～13)×103，易溶于水。从结构上看其分子形状为球形，直经约为314 nm;Cyt C由其前体和亚铁血红素结合而成;Cyt C前体由104个氨基酸组成，在胞质内合成;Cyt C前体从胞质通过跨膜转运进入线粒体，与线粒体膜间隙的亚铁血红素结合为成熟的Cyt C。在Cyt C中，亚铁血红素与轴向配体甲硫氨酸和组氨酸形成配位键，亚铁血红素上2-，4-位的乙烯基和肽链上的两个半光氨酸形成两个硫醚键和肽链共价相连，因此Cyt C是稳定的蛋白分子［3］。Cyt C的二级结构有5个α-螺旋:C-端和N-端的2个螺旋，中间的3个螺旋。亚铁血红素为Cyt C的辅基，位于其中心，外围绕一条肽链;亚铁血红素被该肽链紧紧包裹着，仅有一条缝隙使其中的少部分边缘与溶液相接触，此缝隙的面积占整个分子面积的0.06%，研究显示该区域就是Cyt C分子反应活性区域［4］。Cyt C带正电荷，松散地结合于线粒体内膜外侧，而不能通过外膜。Cyt C是呼吸链中一个重要的电子载体，通过辅基中心的铁离子的价态变化在Cyt C还原酶和Cyt C氧化酶之间传递电子［5］。

2 Cyt C与心肌细胞凋亡

细胞凋亡(apoptosis)是细胞程序性死亡，细胞在一定的生理或病理条件下，由一系列酶参与、基因自主控制的一个主动的、高度遵循自身程序的死亡过程。最初对其认识集中在形态学上，如细胞膜的对称性丧失、细胞皱缩、染色质凝聚、DNA的碎裂、线粒体的肿胀、凋亡小体的形成等。近年来人们对凋亡的认识已经从细胞核的改变发展为重视线粒体的作用。在凋亡过程中，线粒体呼吸链电子传递中断、自由基产生、能量供应受阻。在检测到经典的细胞凋亡特征以前，线粒体膜完整性就已经发生了变化。这些变化涉及到线粒体内膜和外膜的改变，包括内膜跨膜电位的丧失和(或)蛋白质通过外膜的释放;在细胞凋亡中，线粒体起着中心调控作用。在某种意义上，线粒体可以决定细胞的生存或死亡［6］。线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来越引起人们的重视，线粒体释放Cyt C是细胞凋亡信号转导过程的关键因素［7］。

1996年，美国埃默里大学研究小组最先发现线粒体通过释放Cyt C诱导细胞凋亡，认为Cyt C在细胞凋亡中有重要作用，研究显示外源型的Cyt C也可以诱导凋亡［8］。Pullerits等［9］研究发现向大鼠关节炎关节腔内注射不同剂量的Cyt C，3～10 d后发现75%关节出现细胞凋亡和典型关节炎的病理组织学的征象，认为一定浓度的细胞外Cyt C可诱导凋亡导致大鼠关节炎。陈日玲等［10］发现高浓度Cyt C对白血病细胞有诱导凋亡的作用，而且Cyt C诱导凋亡的作用有一定的时间效应［11］。现在普遍认为Cyt C从线粒体释放到胞质是多种细胞凋亡的共同途径［2］。Cyt C从线粒体释放到胞质有以下两条途径:①通过线粒体渗透转运孔，该过程伴随线粒体膜的除极。正常细胞中线粒体渗透转运孔与抗凋亡家族成员Bcl-2与Bcl-xL有协同作用，维持线粒体正常的生理功能。在凋亡刺激因素作用下，线粒体渗透转运孔的孔径明显增大，引起外膜破坏并最终导致Cyt C从线粒体释放［12］。②其他的电压依从性离子通道关闭引起线粒体超极化。在一些凋亡刺激因素的作用下，电压依从性离子通道关闭使ATP/ADP交换出现障碍，从而ATP生成减少，质子跨膜转运功能降低，最终阻碍H+重新进入线粒体基质，导致基质内的负电荷明显增加，由此线粒体内膜发生了超极化，使线粒体跨膜电位(Δψm)增加，引起线粒体渗透性扩张。由于线粒体内膜向腔内延展性相对较大，故水肿后外膜先破裂，位于膜间隙的Cyt C便释放入胞质［13］。近年来对Cyt C释放后导致细胞凋亡机制的研究集中于Cyt C介导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)转变的枢纽作用上来，该机制对引发凋亡起关键作用。释放到细胞质中的Cyt C与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)、dATP、procaspase-9组成凋亡复合体，同时激活caspase-9，活化的caspase-9再激活其下游的caspase-3、6、7等，该组 caspase作用于 DNA修复酶、ADP-核糖聚合酶等，引起细胞DNA修复功能障碍。同时，激活细胞核里内切酶，该酶切割DNA使DNA片段化，最终导致细胞凋亡［14］。Cyt C从线粒体释放到caspase级联活化是细胞凋亡的最关键步骤［15］。Ben-Ari等［16］发现用化疗药物、星形孢菌素诱导人类的Jurkat T细胞系和小鼠的L929成纤维细胞的凋亡时，发现细胞质Cyt C水平增高，同时在细胞外培养液也可以大量检测到Cyt C，该研究认为Cyt C不仅进入细胞质诱导凋亡，另外也由凋亡细胞释放出到细胞外，表明监测细胞血清Cyt C水平可作为监测体内细胞凋亡的一个指标。现在检测血清Cyt C水平已应用到癌症、肝脏疾病、严重脑病的细胞凋亡检测中［17-18］。

在上述研究的基础上，针对Cyt C在急性心肌梗死心肌细胞凋亡中作用的研究也日趋增多。周舟等［19］对大鼠心肌细胞缺氧后的反应进行研究发现，正常心肌细胞胞质蛋白中Cyt C蛋白含量甚微。缺氧3 h后发现线粒体Cyt C无显著变化，而胞质内Cyt C开始增多;缺氧6 h后，胞质内的Cyt C含量已达到峰值水平，线粒体内Cyt C明显减少;缺氧12 h后，线粒体内大部分Cyt C已释放至胞质中;缺氧24 h后在线粒体中已不能检测到Cyt C;同时发现正常情况下心肌细胞的caspase-3呈微量的表达，缺氧3 h后心肌细胞的caspase-3表达开始增高，缺氧6 h后心肌细胞的caspase-3表达达到峰值水平，缺氧24 h后心肌细胞的caspase-3表达仍维持在峰值状态。同时发现缺氧6 h后出现心肌细胞凋亡，并且心肌细胞存活率开始降低，缺氧12 h后心肌细胞凋亡明显增多，此时细胞存活率显著低于对照值，缺氧24 h后心肌细胞凋亡显著增多，此时细胞存活率下降约42%，研究结果表明缺氧可致心肌细胞线粒体中Cyt C大量释放，导致caspase-3激活，从而导致心肌细胞凋亡，心肌细胞Cyt C的释放程度可作为细胞凋亡的分子生物学指标。张晖等［20］发现聚腺苷二磷酸核糖聚合酶被caspase-3降解是细胞凋亡的标志，预示着细胞凋亡的开始，在此基础上结扎大鼠冠状动脉前降支后研究的结果显示，在结扎冠状动脉5 min时在心肌细胞的胞质中检测到少量Cyt C，但未发生聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的降解，此时受损区域的细胞可能仍处于可逆性凋亡阶段;在结扎冠状动脉20 min时，Cyt C的释放量有所增加，同时有细胞发生了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶降解，此时受损区域有少量细胞已经进入了不可逆性凋亡阶段;在结扎冠状动脉45 min时，有大片细胞发生了Cyt C释放和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的蛋白水解，此时受损区域大片心肌细胞发生了不可逆性凋亡。研究结果表明，缺血后心肌细胞Cyt C的释放程度可反映心肌细胞的凋亡程度［20］。朱磊等［21］结扎40只雄性 SD大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型，结果与假手术组比较，实验组细胞凋亡指数表达均增高，线粒体膜电位均降低，心肌细胞的胞质Cyt C表达增加而其线粒体内Cyt C表达减少;实验组内心肌梗死严重的组较其余各组也得出相同结果，研究显示大鼠心肌细胞凋亡加重时，Cyt C胞质表达增多，并且Cyt C胞质表达程度可以反映心肌细胞的凋亡程度。

抑制心肌细胞凋亡时Cyt C胞质表达也同时减少。延迟再灌注能减少梗死周边缺血区心肌细胞的凋亡，同时Cyt C胞质表达也同时减少［22］。夏铭蔚等［23］对结扎犬前降支后的梗死心肌进行研究，发现普通灌注组凋亡指数为(32.6±1.44)%，灌注+曲美他嗪组凋亡指数为(29.13±1.29)%，灌注+曲美他嗪组CytC胞质表达明显低于普通灌注组，两者比较差异有统计学意义。两组分别与假手术组［凋亡指数为(0.47±0.36)%］比较差异均有统计学意义。研究显示曲美他嗪可减少梗死周边缺血区心肌细胞的凋亡，心肌细胞凋亡减少的同时观察到Cyt C胞质表达也减少。

3 Cyt C评价心肌细胞凋亡在临床中的应用

急性心肌梗死后梗死周边缺血区心肌细胞的凋亡能持续相当长的一段时间［1］，常规测量细胞内酶不能反映心肌细胞凋亡。James［24］对77例死于心肌梗死患者的心脏进行解剖，发现在心肌梗死的心脏同时存在细胞凋亡和坏死，坏死的心肌细胞迅速解体，引起急性炎症。心肌细胞凋亡保留其细胞膜的完整性，不引起急性炎症。认为心肌梗死酶法诊断只能反映心肌梗死坏死的那部分，测量细胞内酶的任何结果总是低估心肌梗死的程度，需要对心肌细胞凋亡进行确切的评价。Alleyne等［25］用化学发光法检测发现心肌梗死患者血清中Cyt C水平较正常对照组高，认为血清Cyt C有诊断心肌细胞凋亡的潜力。Marenzi等［26］发现急性心肌梗死患者心肌细胞凋亡加重时，Cyt C血清含量同步增加，认为血清Cyt C含量的变化可以反映心肌细胞凋亡程度的改变。综上所述，Cyt C是评价心肌梗死心肌细胞凋亡的分子生物学指标。

4 结语

急性心肌梗死后心肌细胞凋亡存在时间长，引起左心室扩张、心力衰竭等严重的不良事件。Cyt C是评价心肌梗死心肌细胞凋亡的生物学指标，Cyt C的胞质表达程度可以反映心肌细胞的凋亡程度。相信随着研究的不断深入，可以从一个全新的角度认识心肌梗死。在制订治疗方案时，可以定量分析细胞凋亡时间窗及其对心肌的影响，为心肌梗死的治疗和预防措施提供更为科学的依据。

［1］ Abbate A，Biondi-Zoccai GG，Bussani R，et al.Increased myocardial apoptosis in patients with unfavorable left ventricular remodeling and early symptomatic post-infarction heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，2003，41(5):753-760.

［2］ Jeong SY，Seol DW.The role of mitochondria in apoptosis［J］.BMB Rep，2008，41(1):11-22.

［3］ Sanders C，Turkarslan S，Lee DW，et al.Cytochrome c biogenesis:the Ccm system［J］.Trends Microbiol，2010，18(6):266-274.

［4］ De Biase PM，Paggi DA，Doctorovich F，et al.Molecular basis for the electric field modulation of cytochrome C structure and function［J］.J Am Chem Soc，2009，131(44):16248-16256.

［5］ Watzke N，Diekert K，Obrdlik P.Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes［J］.Biochemistry，2010，49(48):10308-10318.

［6］ Karbowski M.Mitochondria on guard:role of mitochondrial fusion and fission in the regulation of apoptosis［J］.Adv Exp Med Biol，2010，687:131-42.

［7］ Tam ZY，Cai YH，Gunawan R.Elucidating cytochrome C release from mitochondria:insights from an in silico three-dimensional model［J］.Biophys，2010，99(10):3155-3163.

［8］ Liu X，Kim CN，Yang J，et al.Induction of apoptotic program in cell-free extracts:requirement for dATP and cytochrome C［J］.Cell，1996，86(1):147-l57.

［9］ Pullerits R，Bokarewa M，Jonsson IM，et al.Extracellular cytochrome c，a mitochondrial apoptosis-related protein，induces arthritis［J］.Rheumatology(Oxford)，2005，44(1):32-39.

［10］ 陈日玲，谷仁凯，陈铭珍，等.细胞色素C诱导白血病细胞株HL-60凋亡效应的分析［J］.中华血液学杂志，2001，22(12):663-664.

［11］ 陈日玲，陈铭珍，蔡康荣，等.细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡及其周期特异性分析［J］.实用肿瘤学杂志，2004，18(3):163-166.

［12］ 马宇洁，杨兴易，林兆奋，等.大鼠心肺复苏后神经细胞线粒体通透性转换孔变化在细胞色素C释放中的作用［J］.中华急诊医学杂志，2010，19(10):1015-1018.

［13］ Ryu SY，Peixoto PM，Teijido O，et al.Role of mitochondrialion channels in cell death［J］.Biofactors，2010，36(4):255-263.

［14］ 陈建伟.细胞色素C与caspase家族在缺血/再灌注所致心肌细胞凋亡中的作用［J］.医学综述，2009，15(2):173-176.

［15］ Cao XH，Zhao SS，Liu DY，et al.ROS-Ca2+is associated with mitochondria permeability transition pore involved in surfactin-induced MCF-7 cells apoptosis［J］.Chem Biol Interact，2011，190(1):16-27.

［16］ Ben-Ari Z，Schmilovotz-Weiss H，Belinki A，et al.Rapid extracellular release of cytochrome c is specific for apoptosis and marks cell death in vivo［J］.Blood，2001，98(5):1542-1548.

［17］ Osaka A，Hasegawa H，Yamada Y，et al.A novel role of serum cytochrome c as a tumor marker in patients with operable cancer［J］.Cancer Res Clin Oncol，2008，135(3):371-377.

［18］ Ben-Ari Z，Schmilovotz-Weiss H，Belinki A，et al.Circulating soluble cytochrome c in liver disease as a marker of apoptosis［J］.J Inter Med，2003，254(2):168-175.

［19］ 周舟，王小华，朱光旭，等.Caspase-3、-9表达上调参与缺氧诱导心肌细胞凋亡［J］.第三军医大学学报，2005，27(3):185-188.

［20］ 张晖，顾兴华，徐丹令，等.大鼠急性心肌梗死后缺血缺氧心肌早期凋亡信号分子的变化［J］.复旦学报(医学版)，2007，34(4):477-481.

［21］ 朱磊，夏勇.非糖尿病大鼠急性心肌梗死后急性高血糖对心肌细胞线粒体膜电位和细胞色素 C的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2010，18(7):547-551.

［22］ Ma LK，Qu CF，Xu SD，et al.Late reperfusion of infarct-related coronary artery on cardiocyte apoptosis after acute myocardial infarction in dogs［J］.Chin J Arterioscler，2006，14(4):289-292.

［23］ 夏铭蔚，马礼坤，余华，等.曲美他嗪对犬急性心肌梗死后延迟再灌注中缺血区心肌细胞凋亡的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(5):649-653.

［24］ James TN.The variable morphological coexistence of apoptosis and necrosis in human myocardial infarction:significance for understanding its pathogenesis，clinical course，diagnosis and prognosis［J］.Coron Artery Dis，1998，9(5):291-308.

［25］ Alleyne T，Joseph J，Sampson V.Cytochrome-c detection:a diagnostic marker for myocardial infarction［J］.Appl Biochem Biotechnol，2001，90(2):97-105.

［26］ Marenzi G，Giorgio M，Trinei M，et al.Circulating cytochrome c as potential biomarker of impaired reperfusion in ST-segment elevation acute myocardial infarction［J］.Am J Cardiol，2010，106(10):1443-1449.