NNRG/ErbB信号通路在神经系统中的研究进展

杨 凯(综述)，田玉科(审校)

(华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室，武汉 430030)

神经调节蛋白(neuregulin，NRG)是在神经系统、心肌发育和神经肌肉接头中起重要作用的一种信号蛋白，可以在神经元和胶质细胞以及心、肝、胃、肺、肾、脾等器官表达。NRG可以通过诱导ErbB受体构象改变，使ErbB蛋白形成二聚体，继而激活酪氨酸激酶，从此激活下游一系列信号通路，参与多种生理病理过程。关于NRG在神经系统中起的作用也已基本明确，但是关于NRG及其受体间的信号转导还不甚了解。现就 NRG/ErbB信号通路在神经系统中的研究进行综述。

1 NRG及其受体ErbB

NRGs是一类家族蛋白分别由4个基因(nrg1-4)来编码。NRG1是一类多肽因子，由nrg-1基因编码的NRG1通过不同的RNA剪切方式可以产生至少30种不同的蛋白形式［1］。最近还克隆鉴定了另外3个nrg基因:nrg-2、nrg-3、nrg-4，其中 nrg-2、nrg-3 编码的NRG样生长因子的生理功能还不清楚，而且NRG2和NRG3与NRG1的同源性分别只有35%和20%。NRG4只在成熟的胰腺细胞中表达，在肌肉中只有低水平表达。虽然几种NRG蛋白分子之间的同源性不高，但都含有相似的结构域，包括免疫球蛋白(Ig)样环状结构域、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域、跨膜区和长度不等的胞内结构域。各类剪切体的EGF样结构域足以介导其与受体ErbB的结合并启动一系列生理效应。NRG1可分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型见于所有的脊椎动物中，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ型主要见于灵长类动物［2］。类型Ⅰ:乙酰胆碱受体诱导活性物质可刺激AchR亚单位mRNA在肌肉细胞中的转录，神经分化因子是从寻找孤儿受体ErbB2的配体实验及乳腺肿瘤细胞分化、增殖的实验中纯化鉴定的。类型Ⅱ:神经胶质生长因子可以促进施万细胞的增殖和存活。类型Ⅲ:感觉和运动神经元衍生因子存在于外周感觉和运动神经元中，以半胱氨酸富集区取代了NRG中的Ig结构域，故又称为Ig(－)或半胱氨酸富集区NRG剪接体。Ⅰ型和Ⅱ型NRG1有时也同称为Ig-NRG1。EGF样结构域存在于所有具有生物学活性的NRG剪接体中，根据EGF样结构域中第5、第6个半胱氨酸间氨基酸的差异又可将NRG1分为α和β型。β型NRG在神经系统中有高表达，而α型表达水平则很低，主要在间叶细胞中表达。

NRG的功能性受体是由ErbB受体酪氨酸激酶所组成的，包括 ErbB1、ErbB2/HER2/neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。ErbB蛋白属于跨膜酪氨酸激酶的EGF受体家族成员。ErbB的命名来源于在禽红白血病B(v-Erb-B)发现的EGF受体的突变体，因而EGF受体亦称为“ErbB1”。人源 ErbB2称为HER2，特指人的EGF受体。ErbB家族的另外两个成员是ErbB3和ErbB4，它们是通过同源克隆技术被发现的。ErbB2、ErbB3和ErbB4分别编码相对分子质量为185×103、160×103和180×103的蛋白酪氨酸激酶。

2 NRG1及其受体ErbB在神经系统的表达

nrg-1 mRNA在啮齿类动物大脑中广泛并且聚集分布。Law等［3］应用原位杂交和Northern分析nrg-1的mRNA在正常成人脑区的表达，nrg-1的mRNA很清晰地在额前皮质(中板层)、海马、小脑、动眼神经核、上丘、红核及黑质致密部出现，在细胞水平，nrg-1 mRNA分布在海马神经元、皮层锥体细胞、中间神经元、小脑浦肯耶细胞及胶质细胞内，靠近原生质核核膜，表明NRG1蛋白位于突触前。免疫组化的方法显示，NRG1蛋白的分布与nrg-1 mRNA一致。特别是锥体神经元、浦肯耶细胞、几个脑干核以及白质的神经元。在正常大鼠中脊髓nrg-1表达含量较低，星形胶质细胞和巨噬细胞/小胶质细胞不表达NRG1。脊髓缺血损伤后主要表达在神经元及星形胶质细胞［4］。nrg-1基因mRNA及其编码的蛋白在中枢神经系统的分布表明该基因对中枢神经系统的神经功能执行及调节有非常重要的作用。

免疫组化及原位杂交显示［5-6］，ErbB2在成年大鼠的全脑表达比较均一，包括灰质核团及白质传导束，脑内大多数神经元及非神经元细胞均表达该受体，而在海马的齿状回和CA1～CA3区小脑的颗粒细胞层相对来说有较高的表达。这说明它的存在是其他受体发挥生理作用的必要条件，但其整体表达水平相对较低。ErbB3 mRNA在端脑、中脑、间脑、菱脑和后脑表达。在这些区域，有髓的神经束表达高水平的ErbB3。ErbB3蛋白在大脑灰质和皮质下核团也有表达，提示神经元一样能表达ErbB3。而ErbB4在脑的较多脑区都有表达，与ErbB3不同的是在纤维束仅有极少量的表达。脊髓缺血损伤后ErbB4在大鼠脊髓内的表达主要集中在后角1，2区的中间神经元，胶质细胞表达较少［4］。

3 ErbB受体的结构及活化

ErbB受体的结构包括胞外结合区结构域(含有两个保守的半胱氨酸富集区)、一个跨膜结构域、一个酪氨酸激酶结构域以及C-末端结构域。ErbB2的酪氨酸激酶区与EGF受体相比有高达80%的同源性，在总体上同源性达到50%。而且，EGF受体、ErbB2和ErbB4在结构上更为相似，与ErbB3则有较大差异。ErbB蛋白之间需形成同源或异源二聚体后才能与NRG结合。ErbB2(HER2/neu)缺乏能够使其激活配体，NRG1介导ErbB2受体的活化需ErbB3或ErbB4的参与，形成异源性二聚体，所以ErbB2又称为共受体。ErbB3虽然能与NRG结合，但是其本身只有很低的激酶活性。在ErbB2的协同作用下，这一活性可提高100倍。所以ErbB3必须依赖异源二聚体的形成通过反式酪氨酸磷酸化激活。而ERBB4既可以与ERBB2、ERBB3形成异源二聚体，也可以自身形成ERBB4/ERBB4同源二聚体。二聚体的形成并不是一个随机的过程，如含有ErbB2的二聚体倾向于形成ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB4异源二聚体，它们与NRGs的亲和力超过了其他类型的二聚体。

4 NRG/ErbB下游信号转导通路

与NRG结合后ErbB形成同源或者异源二聚体，二聚体细胞内的酪氨酸残基发生自身磷酸化，触发了一个复杂的连续分子间的相互作用。磷酸化位点可以与一些接头蛋白结合，如生长因子受体结合蛋白 2、Shc、Sos、磷脂酶 Cγ、磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的 p85 亚基和Src，从而引起了下游信号级联反应，如PI3K/Akt、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)/Ras/Erk1/2、磷脂酶Cγ和成簇黏附激酶，进而直接改变细胞质中的反应进程和基因表达。其中MAPK和PI3K信号通路最为重要，并且两条通路有着相似的作用。

4.1 PI3K信号通路 NRG1与施万细胞、少突细胞及其前体细胞的存活、增殖、迁移、分化均密切联系。目前研究发现，NRG1对少突胶质细胞的发育、分化和施万细胞的增殖作用是通过PI3K/Akt通路完成的［7］。在施万细胞的增殖过程中，除了 PI3K和MAPK外，还有其他信号通路参与［8］。PI3K的另一个下游信号通路蛋白激酶C也参与促进施万细胞增殖，但是蛋白激酶C的功能是否依赖PI3K现在还不得而知。

髓鞘形成也依赖PI3K活性。研究表明形成髓鞘的轴突中三型NRG1的表达水平高于不形成髓鞘的轴突，三型NRG1缺陷的大鼠感觉神经元髓鞘化差，而运用腺病毒介导三型NRG1后又可形成髓鞘，且髓鞘厚度与NRG1水平呈正相关，提示轴突是否形成髓鞘取决于三型NRG1而不依赖于轴突大小，且三型NRG1促髓鞘形成也可能是通过PI3K来完成的，实验证明PI3K在髓鞘形成的多个时期具有重要作用［8，9］。特别值得注意的是，在共培养初期抑制PI3K会完全阻止髓鞘形成，并且施万细胞不能沿着轴突定向形成一对一的联系。这个结果说明在髓鞘形成的早期事件中PI3K是不可缺少的。随着施万细胞包裹和轴突隔离，细胞骨架肌动蛋白的重组引起了广泛的形态学重组。抑制PI3K会通过阻滞RAC和RHO依赖的效应分子来抑制这一初始的形态学改变。另一种可能性PI3K是基底膜合成所必需的。基底膜的合成依赖于轴突信号，是施万细胞早期包裹和髓鞘形成必不可少的。抑制PI3K可能会阻滞基底膜成分表达和分泌所需的轴突信号。

Erlich等［10］发现 EbrB4受体在 PC12细胞中可以由NRG1诱导。在PC12-ErbB4中，NRG通过消除肿瘤坏死因子或者免疫血清来抑制细胞凋亡。细胞在代谢过程中不断产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，如超氧化物自由基、羟自由基和H2O2，并且它们的水平被一些酶和生理性的抗氧化物所调节。在PC12细胞或在神经元中，过量ROS通常伴随着细胞中毒。细胞中NRG的保护作用受到ROS水平调节，而ROS的调节又依赖于PI3K通路。H2O2诱导ROS水平上升引起PC12-ErbB4细胞死亡，然而可以通过NRG激活PI3K抑制ROS的产生并阻止细胞死亡［11］。目前有研究认为，活化的Akt可以磷酸化cAMP反应性结合蛋白而激动促存活因子转录或通过磷酸化BAD、叉头蛋白和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶等来抑制凋亡通路［12-13］。在大脑中动脉栓塞模型缺血后会释放出炎性因子(如白细胞介素1β)，其更容易使神经元损害。这些细胞因子会诱导黏附分子、促炎因子、应力基因的表达。一些干预措施(如使细胞因子失活或者阻滞细胞因子受体)均可以减轻缺血导致的损伤。NRG可以有效降低缺血后应激反应相关基因，如IL-1β的表达和抑制炎性反应［14-15］，这或许是通过核转录因子和PI3K信号通路来调控的［16］。但是，NRG与结合ErbB后对神经元的作用需要ErbB受体被摄入神经元才能发挥作用，抑制ErbB的细胞吞噬现象可以减轻NRG对神经元的影响［17］

4.2 MAPK信号通路 MAPK属于一种Ser/Thr蛋白激酶，可在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成分。MAPK有4个主要亚族:Erk细胞外信号调节激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶、p38MAPK和Erk细胞外信号调节激酶5。在NRG诱导的细胞增殖、分化、促进生存作用中MAPK也发挥诸多作用。早先的实验揭示，PI3K/Akt信号通路在施万细胞生长发育和髓鞘形成中起着关键性的作用，Mek/Erk1/2仅仅起着有限的作用。酪氨酸磷酸酶2(src homology-2 domain-containing phosphatase 2，SHP)作为信号通路的激活剂在Ras/Erk1/2信号通路的调节中起着重要作用。大鼠的神经脊细胞上SHP2特异突变会导致外周神经系统中施万细胞前体细胞的显著减少，同时未成熟施万细胞中SHP2失活会引起大部分髓鞘形成过程的缺失［18］。这与在NRG1/ErbB2/ErbB3突变鼠观察到的表型十分相似。事实上，在缺乏SHP2的施万细胞中，NRG1诱发的细胞增殖和迁移事实上已经被终止。与SHP2突变相似，神经脊Erk1/2的失活导致外周神经施万细胞前体细胞缺乏。这个结果揭示了SHP2依赖的Erk1/2活性的维持在NRG1引发的功能上起着决定性作用。

在神经肌肉接头处，NRG与其受体结合后，经过接头蛋白Shc和生长因子受体结合蛋白2将信号传递给下游的Ras/Raf/Mek/Erk激酶信号转导途径。Ras和Mek为NRG诱导的AchR基因表达所必需，同时NRG还可以激活c-Jun氨基末端激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶5，两者对AchR的调节也是必不可少的，但是PI3K在其中所起的作用不大。

越来越多的证据表明小胶质细胞参与神经病理性疼痛的发生、发展。最近也有报道NRG参与神经病理性疼痛的形成［19］。抑制Mek几乎可以完全逆转由NRG诱导的小胶质细胞增殖并参与机械痛敏，冷痛敏的发生［20］，这说明NRG1的促小胶质细胞增殖作用和参与神经病理性痛可能是通过Mek/Erk1/2来完成的。虽然在NRG鞘内注射时PI3K/Akt会短暂激活，但是其并不参与神经痛的发生。

NRG还可以诱导小脑颗粒细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基向2C亚基转化，提示NRG可能参与了N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的信号传递，从而调节神经突触的可塑性。抑制Ras/Erk可以消除NRG对N-甲基-D-天冬氨酸受体的调节能力，说明Ras/Mek/Erk参与 NRG 的作用［21］。

4.3 双向通路 除了上述所说的酪氨酸残基磷酸化引起下游信号通路活化外还发现了一类新的转导路径。

ErbB4受体经过一系列特定的蛋白酶水解过程产生一个活性肽段ErbB4胞内羧基端区域，这个活性肽段被转运到细胞核中，直接激活某些基因的转录。ErbB4的水解和转运入细胞核是受其配体NRG［22］或蛋白激酶 C的激动剂 TPA所调节的。ErbB4在进行TPA调节的跨膜水解前，还要经过金属蛋白酶肿瘤坏死因子转化酶(tumor necrosis factor α converting enzyme，TACE)作用进行细胞膜上水解［23］，从而将一段相对分子质量为120×103的膜蛋白胞外段释放到细胞外，同时产生一段含有酪氨酸激酶活性相对分子质量为80×103的膜蛋白片段。该跨膜片段进一步被γ分泌酶水解并最终被转运到细胞核中。在这个特定的水解过程中涉及到一系列很重要的蛋白质水解酶，其中γ分泌酶和TACE是非常重要的。实验证明通过剔除TACE发现，TACE对NRG胞内段的脱落是必需的。相对分子质量为80×103的膜蛋白片段的EICD在体外实验中是有活性的，它是全长的ErbB4经过TACE和γ分泌酶等多次酶切后释放到细胞质中的产物。其中γ分泌酶的作用是将该膜上ErbB4片段水解后释放形成可溶的“s80”EICD片段。可溶的“s80”EICD很快被转运到细胞核中。Nrg-ICD还可以转位到核内，结合到锌指转录因子Eos形成Nrg-ICD-Eos复合物，该复合物能结合到突触后致密区蛋白95启动子上启动内源性突触后致密区蛋白95基因的转录，从而上调突触后致密区蛋白95表达，增强N-甲基-D-天冬氨酸受体后信号传递，促进突触可塑性的形成［24］。尽管NRG1胞内段的裂解是依赖γ分泌酶，但是NRG-ICD-EOS复合物诱导的内源性突触后致密区蛋白95的表达却独立于γ分泌酶的调控。而对于少突胶质细胞的成熟来说，γ分泌酶和EICD的入核却是必不可少的［25］。抑制γ分泌酶会使得少突胶质细胞维持在未成熟的水平，而对NRG诱导的神经元发生却没有影响。这可能暗示γ分泌酶在神经系统发生中的作用是特异性的。

5 结语

近年来NRG及其受体ErbB的研究进展迅速，因其生物学功能广泛，故深入研究其分子结构、体内分布、信号转导具有重要意义和广泛的临床应用前景。本研究对NRG/ErbB分子结构，体内分布，下游信号通路中主要的两条PI3K，MAPK作了简单综述，但是其他信号通路，如磷酸脂酶C/IP3肌醇三磷酸/钙离子信号通路、黏着斑激酶和Rac/Cdc42信号通路及各种信号通路间的联系还有待于进一步研究。

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