马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

李继刚，郑建坡，曲占良

（河北大学 生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071002）

马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

李继刚，郑建坡，曲占良

（河北大学 生命科学学院，河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071002）

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况，采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列，并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞，通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中.

非共生血红蛋白；绿色荧光蛋白（GFP）；亚细胞定位；融合表达载体；农杆菌介导转化

植物界存在3种类型血红蛋白：共生型血红蛋白、非共生型血红蛋白和截短型血红蛋白，其中非共生型血红蛋白（nsHbs）又可细分为nsHb1和nsHb2［1］.马铃薯中已发现的非共生血红蛋白属于类型1（即StHb1）.研究表明，nsHb1有极高的O2亲和力和很低的解离常数，一般在植物体内不承担O2的运输和储存功能.nsHb1为胁迫诱导型蛋白，在组织缺氧或低温胁迫条件下，NO和H2O2可影响nsHb1的表达［2-5］，且已有报道，nsHb1的表达可能与植物体抗病应答反应相关［6-7］.本实验室前期分析了马铃薯StHb1基因的表达与致病疫霉（Phytophthorainfestans）侵染及植物抗病通路信号分子NO和H2O2之间的相关性，结果显示，P.infestans及外源NO和H2O2均明显抑制马铃薯感、抗性品种中StHb1基因的表达.

本文在以上研究的基础上，以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为标记基因［8］，对StHb1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内的亚细胞定位情况进行了研究，为阐明马铃薯StHb1基因的生物学功能及在抗病应答机制中发挥的作用提供新的线索.

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

荷兰十五（马铃薯晚疫病感性栽培品种）购自希森马铃薯产业集团有限公司；洋葱购自本地超市；大肠杆菌DH5α菌株、根癌农杆菌LBA4404菌株由本实验室保存；载体pBI121-GFP由本实验室构建及保存；MMLV逆转录酶、高保真Taq酶、限制性核酸内切酶及DNA Marker等均购自TaKaRa（大连）公司；TRIquick Reagent购自Solarbio；其他化学试剂均为国产分析纯；荧光共聚焦显微镜（OLYMPUS，BX 53）.

1.2 方法

1.2.1 马铃薯总RNA的提取

马铃薯荷兰十五块茎经液氮速冻后研磨，按TRIquick Reagent试剂说明书提取块茎的总RNA.以紫外分光光度计测A260／A280比值，并以10g／L琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的质量.

1.2.2 马铃薯StHb1基因的克隆

根据GenBank已收录的序列号为AY151389.1的核酸序列［9］，通过Primer Premier 5.0软件设计基因特异性扩增引物，StHb1-F：5′-GCTCTAGACATCAATCATCATGA-3′（下划线为核酸限制性内切酶XbaI识别位点），StHb1-R：5′-CGGGATCCCCTTCATCTCAGT-3′（下划线为核酸限制性内切酶BamH I识别位点）.以总RNA为模板，反转录获得cDNA并进行PCR扩增.其循环参数为：预变性94℃3min，循环94℃40s，60℃40s，72℃1min，循环35次，补偿延伸72℃10min.扩增产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶回收试剂盒回收目的DNA条带.

1.2.3 融合表达载体的构建

将PCR扩增获得的目的基因StHb1的ORF序列片段与载体pBI121-GFP分别用XbaI和BamH I进行分步双酶切.琼脂糖凝胶电泳检测并回收StHb1基因的ORF序列片段与载体pBI121-GFP大片段DNA.利用T4DNA Ligase将2回收产物进行连接并转化大肠杆菌DH5α.经卡那霉素（Kan）抗性平板筛选，挑取单克隆提取质粒并进行PCR和酶切鉴定.阳性单克隆送北京六合华大基因股份有限公司进行核酸测序鉴定.以Vector NTI Advance11.0软件对测序结果进行分析.

1.2.4 重组质粒的农杆菌转化

参照《分子克隆实验指南》上的方法，制备农杆菌LBA4404的电转化感受态细胞.将重组质粒pBI121-StHb1-GFP和空载质粒pBI121-GFP分别电击转化农杆菌LBA4404.通过利福平（Rif，50mg／L）和卡那霉素（Kan，50mg／L）筛选获得阳性克隆.提取质粒并进行PCR及酶切鉴定.

1.2.5 洋葱内表皮亚细胞定位

参考刘海燕等［10］的方法，将含有pBI121-StHb1-GFP质粒的农杆菌按体积比1／1 000接种于5mL LB液体培养基（含50mg／L Rif和50mg／L Kan），28℃过夜振荡培养.按照1／50的比例转接到50mL LB液体培养基（50mg／L Rif，50mg／L Kan和100μmol／L乙酰丁香酮（AS））上，28℃振荡培养至对数生长期.3 000r／min离心10min收集菌体，并重悬于含10mmol／L MgCl2和100μmol／L AS的MS液体培养基中.OD600调整为0.6左右.

选取新鲜洋葱中层鳞茎，无菌环境下用体积分数为75%的乙醇浸泡10min后，用无菌水洗涤3～5次.将内表皮切成1cm×1cm大小的方块，用镊子撕下内表皮平铺于MS固体培养基中，28℃暗培养24h；然后，将内表皮置于MS重悬菌液20min，用灭菌滤纸吸干表面菌液并平铺于MS固体培养基中，在光周期16h／18h，25℃的条件下共培养1d左右.取出洋葱内表皮细胞，以MS液体培养基清洗并用压片法制片.于荧光显微镜下观察与拍照.同时，以空载体pBI121-GFP转化结果作为对照.

2 结果与分析

2.1 StHb1基因的ORF序列片段的克隆

利用TRIquick Reagent试剂提取荷兰十五（马铃薯感性栽培品种）块茎的总RNA，紫外分光光度计检测A260／A280比值为1.94，琼脂糖凝胶电泳检测如图1a所示，可以清晰地看到28S与18S2条条带且比值约为2∶1.以此总RNA为模板，通过RT-PCR技术克隆到StHb1基因的ORF序列片段（如图1b）.其长度约为500bp，与预期大小（484bp）基本相符.

图1 马铃薯总RNA及StHb1基因ORF片段的克隆Fig.1 Total RNA of potato and cloning of ORF fragment of potato StHb1gene

2.2 融合表达载体的构建

含有目的基因StHb1的ORF序列片段和GFP基因的融合表达载体如图2所示.

由于载体PBI121-GFP序列分析显示XbaI与BamH I 2核酸内切酶酶切位点紧邻，且2内切酶的最适反应温度不同，因此对StHb1基因的ORF序列片段与载体pBI121-GFP进行分步双酶切.回收产物以T4DNA Ligase进行连接并转化大肠杆菌DH5α.经抗生素（Kan）筛选后挑取单克隆提取质粒，以特异性引物StHb1-F与StHb1-R进行PCR扩增鉴定，如图3a中所示，2和7号重组质粒在预期大小（484bp）处有1条明显的特异性扩增条带.用HindⅢ对2和7号质粒进行酶切鉴定（图3b），琼脂糖凝胶电泳结果显示2重组质粒均切出与预期大小（907bp）相符合的DNA条带.阳性重组菌经测序证明StHb1基因正确插入到载体pBI121-GFP中，与GFP基因形成一个1197bp长度的完全融合ORF，其编码399个氨基酸的多肽序列，符合实验设计.

2.3 StHb1-GFP融合蛋白的亚细胞定位

通过农杆菌介导法，将重组质粒导入洋葱鳞茎内表皮细胞内进行瞬时表达，以空载体pBI121-GFP作为对照，培养1d后在荧光显微镜下观察.图4b为对照组GFP蛋白的定位情况，其在细胞核与细胞质中均可以看到GFP的绿色荧光信号.而将StHb1基因的ORF插入到GFP的5′端，在洋葱细胞内表达形成StHb1-GFP融合蛋白，在荧光显微镜下观察发现其主要存在于细胞核中，少量存在于细胞质中，结果如图4d所示.

图2 重组载体pBI121-StHb1-GFPFig.2 Recombinant vector pBI121-StHb1-GFP

图3 重组质粒的鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmids

图4 StHb1-GFP在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of StHb1-GFP in onion epidermal cells

3 讨论

鉴定基因表达产物在细胞中的定位对明确其生物学功能具有重要的意义.GFP因其独特的性质，可以作为报告基因来研究外源基因产物在细胞中的定位、转移及相互作用等，现已广泛用于基因功能研究［10-12］.自1988年首次报道植物非共生血红蛋白以来［13］，为阐明其生物学功能人们已做了大量的亚细胞和组织定位研究.杨礼香等［14］利用AtGLB1-GFP融合基因表达载体在洋葱内表皮细胞中瞬时表达来研究拟南芥AtGLB1蛋白亚细胞定位情况，结果表明AtGLB1-GFP融合蛋白大部分位于细胞核，少量分布于细胞质中.曲占良等人［3］的研究也显示棉花GhHb1-GFP融合蛋白主要分布于细胞核，在细胞质中也存在少量的荧光信号.这些实验结果与Seregélyes等［15］利用免疫组织化学细胞定位技术对苜蓿MHb1蛋白细胞内定位的研究结果基本相符.同时Ross等［16］对水稻nsHb进行的免疫杂交组织定位分析显示，nsHb在根冠细胞、薄壁细胞、糊粉层细胞和维管束细胞等正在分化的组织细胞中优势表达.橡树非共生血红蛋白QpHb1原位杂交结果显示其集中分布于原生木质部、皮层细胞和原表皮［17］.

本研究通过构建StHb1-GFP融合表达载体，采用农杆菌介导法转化洋葱鳞茎内表皮细胞，成功实现了StHb1蛋白的亚细胞定位研究.荧光显微镜观察显示StHb1蛋白主要定位于细胞核内，少量定位于细胞质，该结果与杨礼香、曲占良和Seregélyes等的研究结果基本一致，暗示该基因的功能在高等植物中比较保守.今后，拟采用转基因方法，将该基因在马铃薯植株中过表达或敲低表达，为进一步明确其功能提供更多有力证据.

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Subcellular localization of StHb1protein from potato

LI Jigang，ZHENG Jianpo，QU Zhanliang
（Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

To identify the subcellular location of StHb1protein，a cDNA encoding nonsymbiotic hemoglobin（StHb1）was cloned fromSolanumtuberosumby RT-PCR，and fused to the 5′end of the green fluorescent protein gene to generate plant binary vector pBI121-StHb1-GFP.It was introduced into onion epidermal cells viaAgrobacterium-mediated transformation.Subcellular localization of StHb1protein was detected by fluorescent microscopy.The results showed that the StHb1-GFP fusion proteins were predominantly present in the nucleus.

non-symbiotic hemoglobin；green fluorescent protein（GFP）；subcellular localization；fusion expression vector；Agrobacterium-mediated transformation

Q789

A

1000-1565（2012）05-0523-05

2011-11-23

河北大学博士基金资助项目（2007-097）；河北省教育厅资助项目（2007412）；河北省科技支撑计划项目（11215529）

李继刚（1974-），男，山东胶南人，河北大学副教授，博士，主要从事植物基因工程方面研究.

E-mail：lijigang＠hbu.edu.cn

赵藏赏）